人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合症(Acquired ImmuneDeficiency Syndrome.AIDS)是人类历史上最严重、最致命的疾病之一,艾滋病目前仍不能治愈。HIV病毒编码的逆转录酶(Revease Transcriptase,RT)将病毒RNA反转录成双链DNA,是病毒复制所必需的关键酶之一,抑制RT的功能能够有效阻断病毒在宿主细胞内的复制。在AIDS治疗中逆转录酶抑制剂必不可少,当前使用最广泛也最行之有效的高效抗逆转录病毒疗法(HAART,俗称鸡尾酒疗法)中,推荐使用至少1个RT抑制剂药物,以RT为靶点的药物研究仍是当前研究的热点之一。随着药物的广泛使用,耐药突变株的出现和传播,亟需发现新药物来抵消耐药性病毒株。　　 本论文构建了pET-28a(+)-p66质粒,表达纯化了有功能活性的重组HIV-1 p66蛋白；并利用实验室何红秋博士建立的检测HIV-1整合酶(Intigrase,IN)链转移活性的高通量ELISA方法,筛选了一批二酮酸类衍生物抑制剂；在培养大肠杆菌表达重组蛋白的过程中,对大肠杆菌磁力搅拌培养方式和摇床振荡培养方式进行了比较研究。主要研究工作包括以下三方面:　　 (1)逆转录酶蛋白表达纯化及活性检测RT是由HIV-1病毒pol基因编码的由p66和p51两个亚单位组成的异二聚体蛋白,其中p51亚单位是p66亚单位C末端RNase H结构域被蛋白酶切割后的产物,HIV-1 R工具有3种活性:RNA依赖的DNA聚合酶活性、DNA依赖的DNA聚合酶活性和RNase H活性。研究表明,p66亚单位含两个催化结构域:聚合酶结构域和RNase H结构域,p51亚单位只含有聚合酶结构域,在HIV-1逆转录过程中仅起辅助性作用。本论文通过PCR技术获取了HXB2CG病毒株RT基因。将目的基因连接到pET-28a表达载体中,成功构建了RT表达质粒pET-28a(+)-p66,通过低温、长时诱导,在大肠杆菌BL21中实现了高效可溶性表达。通过亲和层析方法,从细胞破碎上清液中纯化到纯度高且具有逆转录功能活性的重组RT蛋白。为建立以RT为靶点的药物筛选方法奠定了基础。　　 (2)HIV-1整合酶蛋白的表达纯化及整合酶蛋白链转移活性高通量检测方法的应用抑制HIV-1 IN链转移反应被认为是体内抑制IN功能活性的关键,当前IN抑制剂的体外筛选主要以链转移反应为靶标。由何红秋博士建立的检测HIV-1 IN链转移反应的高通量ELISA方法,通过设计合成了分别用生物素和地高辛修饰的供体DNA和靶DNA,引入了链霉亲和素磁珠捕获反应DNA产物,建立了快速高通量筛选IN抑制剂的检测方法。利用此药物筛选方法筛选了由北京工业大学药物合成室合成的68个二酮酸类衍生物化学合成物,得到2个对整合酶链转移反应活性有较好抑制效果的化合物。　　 (3)大肠杆菌振荡培养与搅拌培养小量表达重组蛋白比较研究大肠杆菌被认为是用于生产重组蛋白的一种稳定并且经济的宿主菌,已被广泛使用数十年。实验室中小量(<2 L)大肠杆菌培养通常采取摇床振荡培养方式,与振荡培养相比,搅拌培养具有耗电少、噪音低、占用空间少等优点。我们比较了大肠杆菌摇床振荡培养(37℃200 rpm)与磁力搅拌培养(37℃600 rpm)两种培养方式表达重组蛋白的效果。从培养物的生长曲线、培养后菌体称重、菌液SDS-PAGE与菌液涂板计数等结果可以看出,在适当的搅拌转速下,磁力搅拌培养方式可以得到比摇床振荡培养浓度更高的培养物。对于实验室中小量表达重组蛋白这一应用来说,磁力搅拌培养是一种行之有效的可取代摇床振荡培养的大肠杆菌培养方式。