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离子通道是位于细胞膜表面的一种膜蛋白,为各种无机离子跨膜运输提供通路。离子通道的主要功能是通过启闭通道控制离子进出细胞,启动细胞内信号传导系统,激活细胞内各种重要的生理活动。迄今甲壳动物离子通道的研究尚少。本文采用分子生物学等方法对拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)钙激活钾通道与电压门控钙通道β亚基基因开展了克隆与表达的研究。主要结果如下:
1)获得拟穴青蟹钙激活钾通道基因(SPSlo)的6种剪接异构体(splicevariants),并发现7个选择性剪接位点。SPSlo的cDNA全长为5882~6095bp,5’-UTR为169bp,3’-UTR为2419bp,开放阅读框为3294~3504bp,编码的多肽由1097~1168个氨基酸组成。得到拟穴青蟹电压门控钙通道β亚基基因(SPCavβ)的6种剪接异构体,发现3个选择性剪接位点。SPCavβ的cDNA全长为2042~2477bp,5’-UTR为416bp,3’-UTR为549bp或205bp,开放阅读框为1359~1659bp,编码的多肽由452~526个氨基酸组成。
2)同源性分析显示,SPSlo和SPCavβ均与其它物种的相应氨基酸序列具有很高的相似性,在生物进化过程中是非常保守的。系统进化树构建发现,两种基因的分子分类地位与现存物种的分类学地位一致。
3)采用实时定量PCR方法分析SPSlo和SPCavβ在拟穴青蟹中的时空表达特征,结果显示SPSlo和SPCavβ广泛分布于成体各组织器官中,且均在脑中高表达,提示SPSlo和SPCavβ可能在脑中执行重要功能。SPSlo在拟穴青蟹卵巢发育早期(Ⅱ期)和发育期(Ⅲ期)表达量显著高于其他各期,提示其可能与卵巢发育过程中卵原细胞增殖及孕酮分泌密切相关。随着卵巢发育,SPCavβ表达量逐渐增加,在将成熟期(Ⅳ期)达到最高,进入成熟期(Ⅴ期)表达量降低。SPCavβ作为SPCav的重要组成,可能在青蟹卵母细胞的成熟过程中发挥作用。
拟穴青蟹SPSlo和SPCavβ基因的克隆及表达研究,将从分子和细胞生理学水平深入了解青蟹的生长生殖等机制,具有重要的理论意义。