研究背景2003年5月笔者接诊了 1例女性患者,24岁,诉“双手背、手腕部皮疹3年”。患者2001年6月无明显诱因于双手指背、掌背、手腕出现棕红色皮疹,部分皮疹高出皮面,无渗出,无痒无痛,皮疹浸水5分钟后变白,离开水源30分钟后皮疹恢复原状,手背、手腕部位出汗明显时,皮疹变白。皮肤科专科检查:手腕、掌背、指背等部位见棕红色斑丘疹,表面粗糙、角化过度,无明显鳞屑,皮损浸水3分钟后变白,干燥后恢复原状,无痒无痛,手掌无任何皮损,组织病理学检查提示表皮网篮状角化过度,棘层肥厚;真皮浅层毛细血管扩张,管周可见少量淋巴细胞浸润。实验室检查:肝肾功能、血常规、血糖等未见异常。给予患者外用氯倍他索霜,每天2次,两周后皮疹有所改善,停药后皮疹有所复发。笔者查阅国内外文献,教科书等,该患者的临床表现不符合任何一种记载的疾病。2003年5月至2008年8月,课题组每年接诊1 0例类似于这种症状患者,期间多次向中国科学院南京皮肤病防治所、北京大学附属第一医院等知名教授请教该种疾病的诊断,但均未能对该种疾病的进行诊断命名,推测可能是一种新的皮肤病。2008年8月,中国科学院南京皮肤病防治所姜袢群等[1]在《临床皮肤科杂志》上首先提出一种新命名的皮肤病----对称性肢端角化病(Symmetric acral keratoderma,SAK),该文报告1 1例以对称性肢端角化为临床表现的患者,对其人口学资料、临床表现、组织病理学特点进行总结,并提出“对称性肢端角化病”这一新的病名,文章中报道了 1 1例患者,其中男9例,女2例,平均年龄35.4岁,平均发病年龄26.5岁;11例患者主要的临床表现为肢端部位如手背、指背、手腕出现对称性褐色角化性斑片,主要分布于掌指关节及其周围、指背、手背两侧和手腕屈侧,足背皮疹症状比较轻微,损害有明显的季节性;组织病理学表现为表皮角化过度和轻度乳头瘤样增生,11例患者的临床表现与现有教科书、文献的任何一种皮肤病均不吻合或无法归属于某种皮肤病,作者认为是一种新的皮肤病病名——对称性肢端角化病。2008年8月,朱晓波等[2]在《中华皮肤科杂志》提出的色素性对称性肢端角化性皮损的一组疾病,该病的临床表现为肢端对称性、棕褐色、角化过度性斑丘疹,皮损多发于手腕、手背、指背、肘部、踝部,遇水皮肤发白,夏天出现皮疹,冬天皮疹可自行消退,患者多无自觉症状。截至2013年7月,国内有1 1篇类似文献报道,累计报道病例105例,但这些个案报道的样本量都比较小[3-12]。以上的研究报道总结了 SAK的临床表现及部分病例的组织病理学改变,但是对于一个新的疾病,我们单纯了解简单的临床表现及组织病理学变化是不足够的,我们需要深入了解SAK的人口学特征、临床特征、组织病理学特征、超微结构变化及发病机制,为控制和治愈该病提供依据。为了深入研究一个新的皮肤病——SAK,本研究对SAK分三部分进行研究。第一部分研究采用临床观察、皮肤生理测试仪、组织病理学、电镜及免疫组化研究SAK的人口学特征、临床特征、组织病理学特征、超微结构特征及免疫表型。第二部分研究采用全基因组外显子测序技术鉴定SAK的致病基因。第三部分研究采用细胞生物学实验对SAK致病基因进行功能验证。第一章对称性肢端角化病的临床及组织病理学研究目的:探讨SAK的人口学特征、临床特征及组织病理学特征。方法:回顾性总结SAK患者人口学特征及临床特征。采用皮肤生理测试仪测试SAK患者皮损区皮脂含量、角质层含水量、皮肤经表皮水分流失量(transepidermal water loss,TEWL)。采用组织病理学检查方法观察SAK患者组织病理学特征;采用透视电镜方法观察SAK患者超微结构特征;采用免疫组化研究方法观察SAK患者角质形成细胞分化蛋白角蛋白(Keratin,KRT)1、角蛋白14,角质化包膜蛋白兜甲蛋白(Loricrin)及内皮蛋白(Involucrin)表达的变化。结果:共收集了 71例SAK患者,人口学特征、临床特征、组织病理学特征及超微结构特征如下:(1)本病好发于男性,男女比例为9.14:1;本病好发于中青年,平均年龄24.02±9.10岁;(2)染料或化学物品容易诱发该病,制衣工人、装修工人或化工厂工人所占病例较多(40.85%);(3)皮损为棕褐色或棕黑色斑疹、斑丘疹,角化过度,界限清楚,无浸润,皮肤浸水后变白,干燥后恢复原状;(4)皮损呈对称性肢端分布,好发于指背、手掌背、手腕、掌侧缘、踝部、膝部及肘部;掌跖部位不受累;(5)皮损呈明显季节性变化,夏季发作,冬天自然缓解,患者多无自觉症状;(6)14.08%患者合并寻常型鱼鳞病,1 1.27%患者合并手足多汗症,11.27%患者有家族史;(7)SAK患者组的皮脂含量、角质层含水量明显低于健康对照组(t=9.455,P=0.000;t=8.904,P=0.000),TEWL值明显高于健康对照组(t=3.709,P=0.001);(8)组织病理学特征为:表皮网篮状角化过度,棘层肥厚;真皮浅层毛细血管扩张,管周可见少量淋巴细胞浸润,汗腺丰富,汗管扩张;(9)超微结构变化为表皮角质层增厚,角蛋白丝紊乱,角质化包膜不均匀。棘层、颗粒层,核周角蛋白丝聚集、张力纤维丝聚集;(10)KRT1蛋白在SAK患者皮损中的表达强度较正常皮肤增强。KRT14蛋白在SAK患者皮损中的表达强度较正常皮肤增强。兜甲蛋白蛋白SAK患者皮损中的表达强度较正常皮肤增强。内皮蛋白在SAK患者皮损中的表达强度较正常皮肤增强。结论:SAK好发于中青年男性患者,典型症状为肢端部位角化过度性棕褐色或棕黑色斑疹、斑丘疹,皮肤屏障功能受损。典型组织病理学特征为表皮网篮状角化过度,棘层肥厚,汗管扩张。典型超微结构为表皮角化过度,角蛋白丝和张力丝紊乱。免疫表型特征为KRT1、KTR14、兜甲蛋白及内皮蛋白过度表达。第二章 应用全基因组外显子测序技术鉴定SAK家系患者致病基因的研究目的:通过全基因组外显子测序技术鉴定SAK患者的候选致病基因。方法:(1)收集SAK患者一个家系连续4代共1 1人。(2)利用Agilent SureSelect Human All Exon51M对一个SAK家系(家系1)中的2个患者和1个对照进行了全基因组外显子捕获,然后用Illumina Hiseq 2500 rapid PE90高通量测序仪进行双末端测序。(3)原始图像文件用Illumina basecalling Software 1.7进行序列读取,将Reads序列通过SOAPaligner 2.20比对到人类参照基因组(NCBI build 36.3,hg19)上。目标区域的基因型通过SOAPsnp(v1.03)来读取。不同于参照基因组的基因型被筛选出作为候选SNPs,另外,通过GATK流程来读取编码区域的插入或缺失。(4)对所有的变异体进行功能注释。筛选出可能对基因功能有显著影响的非同义突变(Nonsysnonymous,NS)、剪切位点突变(Splice acceptor and donor site,SS)和编码区插入或缺失(Coding indels,I)。将2个患者的NS/SS/I在可得的公共数据库(dbSNP129,8个HapMap外显子组和千人基因组变异体数据库)中进行过滤,再跟1个对照进行过滤。筛选出2个患者共有,公共变异体数据库和1个对照没有的变异体作为候选变异体。再用ANNOVAR和GERP来评估这些候选变异体对基因功能的影响,筛选出SAK可能的致病基因/变异。(5)对筛选出来的SAK可能的致病变异体在家系1中的4个患者和7个正常人进行Sanger测序验证,筛选出与SAK表型共传递的变异体。(6)对家系1中与SAK表型共传递的变异体所在的基因,在家系2及另外的独立28例SAK样本中进行基因所有编码外显子和侧翼区的Sanger测序。对所有SAK致病基因突变在100个健康人的外显子组数据中筛查,排除多态性。(7)免疫组织化学研究SAK致病基因在正常皮肤中及患者皮损中的表达。结果:家系1中3个个体的全基因组外显子数据通过与参照基因组比对、变异体读取及逐步过滤,得出2个患者共有、公共数据库和1个对照没有的67个候选变异体,对67个候选变异体重新进行SIFT和GERP筛选,中有21个被SIFT预测有害,45个GERP分值>2,被两者同时预测为有害的突变基因仅为T细胞因子4(T cell factor 4,TCF4)基因。家系1中的4个患者均携带该错义突变TCF4 c.85C>A(p.P29T)基因,但7个正常人均不携带,该突变与SAK表型共传递。TCF4(c.85C>A)基因突变在100个健康人外显子数据中不存在,排除多态性。家系2患者及28例SAK散发病例未检测到TCF4基因突变。TCF4蛋白在正常皮肤的角质形成细胞中颗粒层、棘层、基底层均有表达,主要在胞浆和包膜位置。TCF4蛋白在SAK患者皮损中的表达强度低于正常皮肤中的表达。结论:本研究采用全基因组外显子测序方法,成功发现了 SAK一家系的致病基因TCF4 c.85C>A(p.P29T)。SAK患者皮损中TCF4蛋白的表达降低。第三章 TCF4(c.85C>A)突变基因功能的研究目的:探讨TCF4(c.85C>A)突变基因的功能。方法:(1)利用实时荧光定量PCR及免疫印迹试验(Western blot)验证TCF4在人永生化角质形成细胞株(Human keratinocyte cell line,Hacat)的表达。(2)构建突变型TCF4(c.85C>A)慢病毒载体、野生型TCF4慢病毒载体,转染Hacat细胞株。(3)通过细胞增殖试验、流式细胞术、实时荧光定量PCR及免疫印迹试验等方法检测突变型TCF4及野生型TCF4对角质形成细胞增殖、分化及凋亡的影响。结果:(1)成功验证Hacat细胞株TCF4基因及蛋白的表达。(2)成功构建突变型TCF4(c.85C>A)慢病毒载体、野生型TCF4慢病毒载体,转染转染Hacat细胞株。(3)突变型的TCF4和野生型TCF4增加Hacat细胞的增殖,突变型TCF4相对与野生型TCF4组相比,增殖率降低。突变型TCF4及野生型TCF4组,细胞周期中S期细胞比率上升。突变型及野生型TCF4对Hacat细胞的凋亡没有显著影响。突变型TCF4及野生型TCF4组TCF4mRNA及蛋白、KRT1mRNA及蛋白、内皮蛋白mRNA及蛋白,兜甲蛋白mRNA及蛋白的表达均高于慢病毒载体组的表达。突变型TCF4组KRT14 mRNA及蛋白的表达低于慢病毒载体组;野生型TCF4组KRT14 mRNA及蛋白的表达高于慢病毒载体组。结论:野生型TCF4及突变型TCF4可能会加速角质形成细胞的角化分化过程。