【摘 要】
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1.以猪伪狂犬病毒(PRV)的基因组序列作为参考,设计了应用在同一个PCR反应体系的3对特异性扩增引物,建立了鉴别诊断PRV疫苗株和流行毒株的多重PCR方法(Multiplex PCR,Multi-PC
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1.以猪伪狂犬病毒(PRV)的基因组序列作为参考,设计了应用在同一个PCR反应体系的3对特异性扩增引物,建立了鉴别诊断PRV疫苗株和流行毒株的多重PCR方法(Multiplex PCR,Multi-PCR)。在相同的PCR扩增条件下,以PRV DNA作为模版,同时加入3对特异性引物,可同时扩增不同长度的PRV gB,gE和Tk基因序片段,其大小分别为427bp(gB),298bp(gE)和208bp(Tk)。利用建立的Multi-PCR方法,对商品化的四种不同基因缺失的PRV疫苗进行检测,其扩增结果与疫苗的基因缺失背景一致。试验结果表明,Multi-PCR可同时区分PRV流行毒株和疫苗毒株,且具有良好的敏感性和特异性,最低检出DNA含量为10-5(13.75pg/μl)。该方法可应用在PRV临床诊断和流行病学调查研究工作中。2.根据GenBank上猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)的已发表序列分别设计并合成4对特异性扩增引物建立PRV,PCV2,PPV单项PCR检测方法。分别扩增出预期的657bp(PPV),490bp(PCV2),372 bp(PRV-gB)和298bp(PRV-gE)片段,在优化单项PCR反应条件基础上建立了PRV-PCV2-PPV复合PCR检测方法,为预防和控制上述3种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法,PPV、PCV2、PRV-gB、PRV-gE检测敏感性分别为10-5(17.4pg/μl),10-5(14.1pg/μl),10-5(11.7pg/μl),10-5(11.7pg/μl)。3.为促进PCR反应中猪伪狂犬病毒gB基因的扩增效率,研制了含有二甲基亚砜(DMSO)成份的针对gB基因的PCR缓冲液。结果表明:在DMSO作用下,增强了gB基因扩增特异性,4%～10%的DMSO可以获得最佳扩增效果。
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