论文部分内容阅读
防御素（defensins）是机体抵御病原微生物时机体免疫防御过程中合成并分泌的一类重要的抗菌肽。它具有十分广泛的抗菌谱,对细菌、真菌、披膜病毒等多种病原都具有杀伤作用,对支原体、衣原体以及一些恶性细胞具有一定的抑制杀伤作用。其独特的杀菌机制,难以诱发细菌的耐药性,成为有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1（porcineβ-defensin-1,PBD-1）广泛存在于猪消化系统、呼吸系统和免疫系统等多个系统器官组织,在猪只固有免疫中具有重要作用。干酪乳酸杆菌（Lb.casei）广泛存在于人和动物肠道内,具有天然的抑菌作用,是一种公认的有益微生物。乳酸杆菌是至今发现的极少没有致病性的菌种,经过筛选的菌株能够抵抗胃酸和胆盐,所以Lb.casei可以通过口服的方式进入人和动物的肠道并大量定植进而达到大量运输异源蛋白的目的。而大肠杆菌作为首个重组蛋白表达宿主菌,其遗传背景清晰,易于控制表达、生产周期短等特性,成为外源基因表达的首选宿主。大肠杆菌Rosetta（DE3）含有6种稀有密码子对应的tRNA,可以避免密码子使用频率高而导致转录限制,可以提高外源真核基因的翻译水平。试验首先通过反转录-聚合酶链试反应（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）方法从猪舌总RNA中扩增得到PBD-1的全基因（PBD1Q）,插入克隆载体pMD18-T。经酶切鉴定及序列测定,证实成功构建克隆载体pMD18T-PBD1Q。为构建干酪乳酸杆菌整合型表达载体,首先先人工合成150 bp的短小乳酸杆菌信号肽（SP）序列,构建出pUCK-SP载体。再从pMD18T-PBD1Q质粒上扩增出168bp的包含His-tag序列的猪PBD-1成熟肽基因的序列PBD1His,插入SP下游,构建pUCK-SP-PBD1His质粒。质粒经酶切回收SP-PBD1His片段,然后插入pMJ67载体。经序列测定证明成功构建出整合型表达质粒pMJ67-SP-PBD1His。利用电转化方法,将重组整合型质粒转进干酪乳酸菌,经鉴定,证实重组猪PBD1His基因的Lb.casei构建成功。经半定量RT-PCR和Western blot分析,证实猪PBD1His基因在重组Lb.casei菌体内获得了表达。而在构建大肠杆菌复制型表达载体时,在pET28a质粒的Nde I和BamH I之间插入SUMO蛋白标签,替代其原有的T7标签。通过PCR方法从pMD18-PBD1Q质粒上扩增出129 bp猪PBD-1成熟肽基因序列PBD1,插入pET28a-SUMO载体Bam HⅠ和Xho I酶切位点之间,随后测序结果证实大肠杆菌复制型表达质粒pET28a-SUMO-PBD1构建完成。采用物理热冲击方法,将pET28a-SUMO-PBD1复制型表达载体导入大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞。经卡那霉素筛选及序列测定,证明重组PBD1大肠杆菌构建成功。经过SDS-PAGE和Western blot分析表明,经过IPTG诱导,猪PBD1在Rosetta（DE3）菌体内获得了表达。诱导条件经优化,重组菌菌体内表达PBD1最佳条件（诱导剂终浓度为0.6 mM,诱导时间为6 h）。