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蒽环类药物,包括多柔比星(Doxorubicin,DOX)、表柔比星(Epirubicin,EPI)、吡柔比星(Pirarubicin,THP)等,广泛用于实体恶性肿瘤和血液系统肿瘤的治疗,但是蒽环类药物具有诸多不良反应,心脏毒性是其最为严重的不良反应,在一定程度上限制了它的应用。右雷佐生(Dexrazoxane,DZR)是目前FDA唯一批准使用的心脏保护药,但有报道提出DZR可能会加重化疗药物引起的骨髓抑制,因此,临床上亟需寻找一种更加安全有效的心脏保护药。芦丁,又称芸香苷、维生素P、路丁、紫斛皮苷等,是一种来源广泛的黄酮类化合物,主要存在于芸香叶、烟叶等多种植物中,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种重要的生物活性。本课题组前期研究已证实RUT可以改善THP所致的心肌损伤,并制作了RUT干预THP诱导大鼠心肌损伤的miRNA芯片。本研究从miRNA芯片入手,通过生物信息学分析构建了miR-22-5p/RAP1/ERK信号通路,并以该信号通路为切入点研究其在RUT对THP所致大鼠心肌损伤中的作用及机制。以期阐明THP引起心肌损伤的分子机制,为RUT改善THP所致心肌损伤提供新靶点。本研究分为3部分:(1)芦丁保护吡柔比星所致大鼠心肌损伤的miRNA芯片生物信息学分析及miR-22-5p/RAP1/ERK信号通路构建首先对芯片结果进行分析。将差异基因的条件设定为p<0.05且|log2 fold change|>0.7,再对比RUT+THP组/THP组及THP组/CON组,选出RUT能回调THP异常变化且在大鼠和人中同源性较好的miRNAs。查阅相关文献确定研究对象miRNA。再通过Target Scan和miRDB数据库对其靶基因预测,采用omicshare和DAVID数据库对预测到的靶基因进行GO分析和KEGG分析,并构建信号通路。结果显示:(1)符合上述条件的miRNAs共18个,其中上调8个,下调10个(RUT+THP组/THP组);(2)查阅文献选择与心脏保护研究相关,且未见有蒽环类药物引起心肌损伤相关报道的miR-22-5p作为研究对象;(3)通过靶基因预测和KEGG富集分析,发现在RAP1A m RNA的3’UTR处有miR-22-5p的潜在结合位点,靶向性较好,且RAP1A位于MAPK信号通路中,由此构建miR-22-5p/RAP1/ERK信号通路,并基于此通路进行RUT对THP所致心肌损伤保护作用的探讨。(2)miR-22-5p/RAP1/ERK信号通路在芦丁改善吡柔比星所致大鼠心肌损伤中的介导作用通过尾静脉注射THP(18mg/kg,分6次)的方法复制大鼠心肌损伤模型,以RUT(50mg/kg)进行预保护。观察大鼠心电图、心功能参数及心肌病理学改变,并以qPCR方法检测大鼠心肌组织中miR-22-5p和RAP1A m RNA的表达,Western blot方法检测大鼠心肌组织中RAP1/ERK通路相关蛋白表达。结果显示:(1)RUT可减轻THP所致的心电图、心功能及心肌病理学改变;(2)RUT可逆转THP导致的miR-22-5p表达下降,与芯片结果一致;(3)RUT可逆转THP所致的RAP1A基因表达、RAP1A蛋白表达和BRAF、MEK1/2、ERK1/2蛋白磷酸化水平增加,提示RUT可能通过miR-22-5p调控RAP1A及下游ERK信号通路介导其对THP所致心肌损伤的保护作用。(3)miR-22-5p在吡柔比星处理大鼠H9c2心肌细胞损伤中的作用及机制研究建立THP诱导H9c2细胞损伤模型,以RUT进行预保护,通过qPCR方法检测RUT对miR-22-5p和RAP1A m RNA表达的影响。构建miR-22-5p过表达/沉默瞬转H9c2细胞株,应用qPCR方法检测miR-22-5p和RAP1A m RNA的表达,并利用ROS、TUNEL、Western blot实验检测细胞内ROS水平、凋亡状况及RAP1/ERK通路上相关蛋白的变化。结果显示:(1)RUT能逆转THP所致的miR-22-5p下调,与芯片结果一致;(2)miR-22-5p过表达时,RAP1A m RNA表达下调,miR-22-5p沉默时,RAP1A m RNA表达上调,miR-22-5p能够靶向调节RAP1A;(3)miR-22-5p能够减少THP所致的H9c2细胞内ROS产生,减少细胞凋亡,使THP所致的RAP1A蛋白表达水平,BRAF、MEK1/2、ERK1/2蛋白磷酸化水平上调作用受到抑制,发挥与RUT同样的作用。上述结果表明RUT可能是通过上调miR-22-5p,抑制RAP1/ERK信号通路的激活发挥心脏保护作用的。综上所述,本研究通过THP复制大鼠心肌/H9c2细胞损伤模型,应用RUT进行预保护,并通过转染技术构建miR-22-5p过表达/沉默瞬转H9c2细胞株,采用ROS、TUNEL、qPCR、Western blot及形态学观察等方法,应用体内和体外实验,从miR-22-5p/RAP1/ERK通路角度系统的探讨RUT保护THP所致心肌损伤的作用及机制,得出如下结论:(1)RUT可改善THP所致的大鼠心电图、心功能及心肌形态学变化,说明RUT对THP所致大鼠心脏毒性具有保护作用。(2)RUT可以逆转THP所致的大鼠心肌组织/H9c2细胞中miR-22-5p表达下调,RAP1A基因及蛋白表达增加,BRAF、MEK1/2、ERK1/2蛋白磷酸化水平增加,减少THP所致的H9c2细胞内ROS产生和细胞凋亡。在H9c2细胞中过表达miR-22-5p与RUT作用相同。提示RUT对THP所致心肌/H9c2细胞损伤的保护作用可能是通过上调miR-22-5p,进而抑制RAP1/ERK信号通路实现的。(3)在H9c2细胞中转染miR-22-5p后,miR-22-5p过表达可下调RAP1A m RNA表达,miR-22-5p沉默可上调RAP1A m RNA表达,证明miR-22-5p可靶向调控RAP1A。