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目前，哺乳动物中己发现的13种TLRs能识别多种微生物及其产物的PAMP。其中以TLR4在肿瘤细胞上的表达最为广泛，且表达丰度较高，因而TLR4在肿瘤的发生、发展中的作用备受关注。本文在以往研究的基础上，通过观察受照后高表达和低表达TLR4的肿瘤细胞的增殖、克隆形成、凋亡、细胞周期和迁移的影响同时将Lewis肺癌细胞与淋巴细胞共培养，观察肿瘤细胞与肿瘤局部免疫细胞相互作用对CD4+CD25+Treg细胞数量的影响。本研究结果将为寻找提高临床肿瘤放疗疗效的新靶标提供新的实验依据。1. TLR4对肿瘤细胞放射敏感性的影响1.1筛选照射后高、低表达TLR4的肿瘤细胞采用流式细胞术检测照射前、后TLR4的表达量，结果显示：与阴性对照组（小鼠正常组织来源的NIH3T3细胞）比较，5Gy X射线照射小鼠肿瘤细胞24h后，小鼠白血病RAW264.7、小鼠肺癌Lewis、小鼠黑色素瘤B16、小鼠肝癌Hepa1-6细胞的TLR4表达比照射前均升高，其中只有Lewis细胞的TLR4表达水平明显高于照射前（P<0.01）；照射后小鼠胃癌细胞MFC的TLR4表达水平比照射前降低，且有统计学意义（P<0.01）。1.2TLR4对受照的Lewis和MFC细胞增殖活性的影响采用CCK8试剂盒检测Lewis和MFC细胞的增殖活性，结果表明：Lewis受5Gy照射后其增殖活性明显低于照射前（P<0.01），经TLR4阻断剂TAK242处理后，其增殖活性明显降低（P<0.05），而用TLR4激动剂LPS处理后，其增殖活性明显升高（P<0.05）。MFC细胞受5Gy照射后其增殖活性明显低于照射前（P<0.01），但与Lewis细胞（51.1%）比较其增殖活性下降幅度小（42.9%），而用TAK242阻断TLR4后再给予照射，其增殖活性明显高于单纯照射组（P<0.05），但明显低于照射前阻断组（P<0.05），LPS处理后其增殖活性均高于相应的对照组（P<0.01）。1.3TLR4对受照的Lewis和MFC细胞克隆形成率的影响用克隆形成实验法检测TLR4对Lewis和MFC的放射敏感性的影响，结果显示Lewis细胞受5Gy照射后其细胞存活分数明显低于照射前（P<0.01），经TLR4阻断剂TAK242处理后，其细胞存活分数明显降低（P<0.01），而用TLR4激动剂LPS处理后，其细胞存活分数明显升高（P<0.01）。MFC细胞受5Gy照射后其细胞存活分数明显低于照射前（P<0.01），经TLR4阻断剂TAK242处理后，其细胞存活分数明显降低（P<0.05），而用TLR4激动剂LPS处理后，其细胞存活分数明显升高（P<0.05）。上述实验结果表明，阻断TLR4后受照射的Lewis和MFC细胞的存活分数均降低，但Lewis降得的幅度更大。而刺激TLR4后受照射的Lewis和MFC细胞对存活分数均升高，且MFC细胞存活分数升高的幅度更大，说明TLR4可能与肿瘤细胞的放射敏感性相关。1.4TLR4对受照的Lewis和MFC细胞凋亡率的影响用流式细胞术检测照射前后Lewis和MFC细胞的凋亡率，结果显示Lewis细胞TAK242阻断TLR4后，其凋亡率明显升高（P<0.05），而用LPS刺激后其凋亡率明显受抑制（P<0.05）。在5Gy照射条件下，TAK242阻断组细胞凋亡率明显高于单纯照射组（P<0.05），且凋亡的幅度高于单纯TAK242阻断组，LPS激动组的细胞凋亡率明显低于单纯照射组（P<0.05）。MFC细胞TAK242阻断TLR4后，其凋亡率明显升高（P<0.05），而用LPS刺激后其凋亡率明显受抑制（P<0.05）。在5Gy照射条件下，TAK242阻断组和LPS刺激组，MFC细胞的凋亡率均低于单纯照射组（P<0.05），且TAK242组凋亡幅度更大。实验结果表明，5Gy照射后，用TAK242阻断TLR4后Lewis细胞凋亡率明显增多而用LPS刺激后其凋亡率明显受抑制。说明TLR4跟辐射诱导的肿瘤细胞凋亡相关。1.5TLR4对受照的Lewis和MFC细胞周期进程的影响用流式细胞术检测照射前后Lewis和MFC细胞周期的变化，结果显示：与空白对照组相比，Lewis细胞受照后G2/M期细胞显著升高（P<0.01），而G0/G1和S期细胞均明显减少（P<0.01）；用TAK242阻断后各周期进程的变化与单纯照射后的变化相似，而用LPS刺激受照后的Lewis细胞，其S期细胞变化不明显，G0/G1期和G2/M期细胞明显减少和增多（P<0.01）。MFC细胞受照后G2/M期细胞显著多于对照组（P<0.01），G0/G1和S期细胞均减少，并有统计学意义（P<0.01）；用TAK242阻断和LPS刺激后MFC细胞各周期进程的变化与单纯照射后的变化相似，说明Lewis细胞的TLR4高表达与其受照后的周期进程无关。1.6TLR4对受照的Lewis和MFC细胞迁移变化的影响.用划痕实验法检测Lewis和MFC细胞的迁移变化，实验结果表明：Lewis和MFC细胞受5Gy照射后用TAK242阻断组与单纯照射组相比，Lewis和MFC细胞划痕宽度明显变宽，且两者相比，Lewis细胞划痕宽度比MFC细胞的更大，而激动剂LPS处理后，Lewis和MFC细胞划痕宽度分别明显缩小和变宽，且两者相比，MFC细胞的划痕宽度更窄。上述实验结果说明，肿瘤细胞产生辐射抗性与TLR4的相关性也体现在肿瘤转移方面可能与其受照后TLR4的表达高低有关。2. TLR4对肿瘤免疫耐受的影响用流式细胞仪检测Lewis肺癌细胞与淋巴细胞共培养体系中Terg细胞数量的变化，实验结果表明：共培养体系受5Gy照射后Terg细胞数量明显低于照射前（P<0.05），而未照射时用TLR4阻断剂TAK242和激动剂LPS处理后，Terg细胞数量分别明显降低和升高（P<0.05）。且5Gy照射后与单纯照射组相比，用TAK242阻断后和用LPS刺激后，Terg细胞数量明显降低和升高（P<0.05），且照射后与照射前相比，未照射组Treg细胞变化的幅度更大，表明照射后肿瘤细胞中TLR4的高表达能促进Treg数量的增多，这可能与Lewis细胞上TLR4的高表达有关。