目的:在恶性肿瘤的发生发展过程中,肿瘤的快速增长导致肿瘤中心发生缺血缺氧,进而伴随着坏死的发生;其次,在肿瘤的治疗过程中,通过物理、化学等手段使肿瘤坏死,进而缩小肿瘤体积甚至根除肿瘤。因此,坏死可用来判断恶性肿瘤的生物学状态和治疗反应。以坏死为靶点,也可以对坏死临近区域的肿瘤残余细胞进行靶向放射治疗或药物治疗[1,2]。肿瘤坏死周边区域是肿瘤的缺血缺氧区,其内存在大量的肿瘤干细胞,直接影响肿瘤的复发、转移和药物耐药[3-5]。以坏死为靶点的治疗药物输送,对预防肿瘤的复发和转移及药物耐药也具有科学和临床意义。然而,肿瘤的区域由于缺少血液供应,且组织压力较高[6],坏死区域的靶向药物输送非常困难。金丝桃素是一种贯叶连翘类的小分子提取物,具有良好的坏死亲和性,可作为肿瘤坏死的靶向分子[7-9]。然而,金丝桃素是疏水性物质,在生理盐水中凝结成块,直接注射入生物体将极大的限制了它的生物利用度。目前尚无安全有效的输送载体,文献所使用的方法均为将金丝桃素溶于有机溶剂再注射至生物体内[10,11]。但是,有机溶剂作为输送介质又引发新的问题。首先是有机溶剂对生物体产生的安全隐患,如溶血、细胞膜的损伤;其次是当有机溶剂经血液稀释时,由于溶解度的降低,金丝桃素极容易聚合成大颗粒沉积于肝脏、脾脏的单核巨噬系统内[12],进而影响其靶向效率和能效[13]。如何能安全有效的将金丝桃素输送至生物体,并发挥其坏死亲和的功能是金丝桃素能否转化的关键。纳米材料由于具有特殊的粒径,较大的比表面积,使其具有特殊的肿瘤内富集效应[14],并且可以改变荷载药物的物理性质,作为载体用于药物的输送已经很长时间[15]。有机纳米材料由于可降解具有更高的安全性。在有机纳米材料合成的过程中,聚乙二醇（PEG）和聚已内酯（PCL）是非常常见的原料,对生物体无毒副作用且能快速降解,目前已被FDA批准并应用于临床。纳米金潜在的X线成像和高电子密度,可用于监测药物和载体在体内的分布[16,17],因此我们提出如下设想:以聚乙二醇-聚已内酯为主体,合成荷载金丝桃素和纳米金的纳米微胶束,利用金丝桃素的荧光特性和坏死亲和性,以及纳米金的X线成像特性,以期达到肿瘤多模态影像监测和靶向坏死的作用,为肿瘤坏死区域的药物输送提供载体,并为验证其功能提供实验依据。方法:1、采用2 mg纳米金、100 ug金丝桃素、5 mg mPEG-PCL溶于2m L四氢呋喃中,充分震荡混匀后,加入2 m L 5%的右旋糖酐构建反应体系,待充分反应后,置于通风橱内避光隔夜以蒸发所有的四氢呋喃,将挥发后的反应体系定容至2mL,再运用0.22 um的过滤器过滤,得到荷载纳米金和金丝桃素的纳米微胶束PNP@AuNP-Hyp。再通过马尔文粒度仪、冰冻透射电子显微镜、暗视野显微镜、紫外可见分光光度计检测其流体动力学直径、表面电荷、分散指数、形貌以及金丝桃素和纳米金的包封率。并将合成的样本保存一月后,重新检测其指标评价其稳定性。2、将梯度金浓度（500、250、125、62.5 ug/m L）的纳米微胶束、PBS和25%DMSO与2.5%的红细胞悬液置于37℃水浴3小时,运用细胞计数器计数完整的红细胞,评估其溶血安全性。将A2780N细胞接种于96孔板,与梯度金浓度（1000、500、125、62.5、31.25 ug/m L）的纳米微胶束共培养,以RPMI1640培养液为阴性对照,25%DMSO为阳性对照,采用Calcein-AM法评价其细胞毒性。将梯度金浓度（0、100、200、400、800、1600、3000 ug/mL）的纳米微胶束置于0.2 m L离心管内。以相同碘浓度的碘海醇为对照,置于Micro-CT进行扫描,观察其X线成像能力。将A2780N细胞与金丝桃素浓度为10ug/mL的纳米微胶束共培养36小时,置于荧光显微镜观察纳米微胶束的细胞吞噬能力和荧光成像能力。采用干冰冷冻法制造细胞坏死模型,将金浓度为100ug/m L的纳米微胶束加入细胞坏死模型中,置于荧光显微镜观察活死细胞之间纳米微胶束的分布,观察纳米微胶束的坏死亲和性。3、2只6周大小的裸鼠,分别列入实验组和对照组,全麻成功后,经皮下大腿外侧背部植入2×106 A2780N细胞,待肿瘤直径达到1.5 cm时造模成功。将实验组裸鼠经尾静脉注射PNP@AuNP-Hyp（纳米金剂量约为8 mg/Kg）,对照组给予200 u L的生理盐水。注射前、注射后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时观察PNP@AuNP-Hyp的荧光成像和X线成像情况。获取纳米材料在裸鼠中成像的最佳点,再次注射相同剂量后处死取材。将肿瘤制作成2 mm的切片,大体观察纳米微胶束的分布。再将部分肿瘤采用OCT包埋后,制作10 um的冰冻切片,荧光显微镜下观察金丝桃素的分布。其余肿瘤组织采用福尔马林固定、石蜡包埋,制作5 um的切片,行HE染色观察金丝桃素的分布与肿瘤坏死之间的关系。再将实验组和对照组裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺、脑组织,进行HE染色观察二者之间的区别评价在体安全性。结果:1、成功合成了荷载金丝桃素和纳米金的纳米微胶束。流体动力学直径为103.9±1.74 nm,PDI=0.121±0.017,Zeta表面电荷=-17.3±4.14。2、冰冻透射电镜及暗视野显微镜显示为单分散的球形纳米颗粒具有良好的遮光性。3、紫外可见分光光度吸收显示了PNP@AuNP-Hyp具有金丝桃素的特异性的吸收峰和纳米金的吸收特点。4、通过对金丝桃素和纳米金制定标准曲线后,将合成的纳米微胶束裂解测定金丝桃素的包封率为93.4%,纳米金的包封率为71.3%。5、将纳米微胶束置于4℃保存一个月后,其流体动力学直径略有缩小,PDI和表面电荷无明显变化,保存过程中仅有10.4%的纳米金和8.8%的金丝桃素丢失。6、在溶血实验中,梯度金浓度的纳米微胶束未显示出明显的溶血效应,结果明显优于对照组25%DMSO。7、在细胞毒性实验中,细胞死亡率随纳米微胶束的浓度的提升而逐渐上升,当纳米微胶束中金浓度为250ug/m L时,其细胞存活率为100.2±13.5%,而浓度提升至500ug/mL时,其细胞存活率为59.8±18.2%,而25%DMSO作为对照组,仅有7.0±0.7%的细胞存活。8、经Micro-CT扫描后,纳米微胶束展示了良好的CT增强效应,PNP@AuNP-Hyp与A2780N肿瘤细胞共培养后,细胞在荧光显微镜上展示了良好的荧光成像,金丝桃素的红色荧光沉积于肿瘤细胞的胞浆中。PNP@AuNP-Hyp与细胞坏死模型共培养后,其主要沉积于坏死细胞中。9、在实验组裸鼠肿瘤模型中,尾静脉注射纳米微胶束后,肿瘤组织的荧光逐渐增强,在注射后30分钟达到峰值,而X线吸收在注射后5分钟达到峰值,之后逐渐下降,在24小时恢复至本底水平。10、将裸鼠尾静脉再次注射纳米微胶束30分钟后处死,取材肿瘤制作2 mm的切片,大体显示肿瘤中心为坏死区,坏死区呈现金丝桃素的高强度荧光,以及相对较高的X线吸收。11、冰冻切片和石蜡切片组织学分析进一步展示了金丝桃素汇集于肿瘤中的坏死区域。12、对实验组和对照组裸鼠的各器官进行组织学对比分析,未见明显的组织学差异。结论:1、采用溶液挥发法合成荷载金丝桃素和纳米金的纳米微胶束PNP@AuNP-Hyp,简单可行,易于操作。所合成的纳米微胶束呈现为单分散球形结构,结构稳定,粒径符合肿瘤应用的标准。2、PNP@AuNP-Hyp是一种安全的金丝桃素输送载体,在安全性方面优于文献中的DMSO输送介质。PNP@AuNP-Hyp具有纳米金的X线成像和金丝桃素的荧光成像、靶向坏死能力。3、PNP@AuNP-Hyp在裸鼠皮下移植瘤坏死模型中,具有荧光成像和X线成像能力,具有肿瘤多模态影像学监测作用。并且PNP@AuNP-Hyp良好的坏死亲和性为后续的坏死亲和相关的研究提供了新的思路。