基于超微结构和组学技术探究企鹅珍珠贝足丝分泌机理

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企鹅珍珠贝(Pteria penguin)是生产附壳珍珠的大型海水经济贝类,其依靠强壮的足丝将自身固定在硬质基底上,抵抗水流的冲击和抵御被捕食等。足丝是由足部腺体分泌的足丝黏附蛋白构成的,足丝蛋白主要分为三类:一类构成足丝角质层,一类构成足丝核心,还有一类则构成足丝黏附斑。关于企鹅珍珠贝足腺种类、足丝蛋白成分及足丝分泌机制的研究尚未见报道。因此,本文旨在通过组织学方法探究企鹅珍珠贝足腺种类;采用蛋白质组学方法分析企鹅珍珠贝足丝蛋白组成,并对参与足丝分泌过程的重要蛋白质进行分析;采用转录组学方法探究冬夏两季中企鹅珍珠贝足丝发生机制的异同。主要研究内容及结果如下:1.采用正在分泌足丝的足(FW)和实验中未分泌足丝的足(FO)制作石蜡切片和超薄切片,经Masson三重染色、天狼星红染色,采用普通光学显微镜和偏振光显微镜观察,结合透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察发现,企鹅珍珠贝足部存在分泌足丝蛋白的胶原腺和酚腺。企鹅珍珠贝足丝蛋白由两腺体中的囊泡运输,囊泡中的分泌颗粒分为三类:椭圆形的胶原腺分泌颗粒、近圆形且电子密度高的酚腺分泌颗粒以及分布松散、密度不定的未知分泌颗粒。足部表面存在着透明胶黏物,但在足腺中未发现粘液腺相关结构。足丝的SEM观察发现,表面平整,存在着嵌入蛋白基质的颗粒物,内部是排列整齐且紧密的线状纤维。足丝线与足丝末端无明显交界处,二者表面结构一致,但足丝末端与基质接触部位呈现泡沫状结构。研究结果有助于了解企鹅珍珠贝足部腺体及足丝结构。2.对企鹅珍珠贝足部(FW和FO)、足丝和珍珠袋(PP)进行4D lable free定量蛋白组学分析。检测并定量到了48422个肽,属于5332个蛋白质。在FW vs PP、FO vs PP和FW vs FO这3个比较组中分别鉴定出1105、1049、157个差异表达蛋白质(DEPs)。与FO相比,FW中DEPs富集在囊泡分泌及微管相关蛋白。结合FW的TEM观察发现足丝蛋白分泌过程中,通过囊泡运输、纤毛运动及微管蛋白将足丝前体蛋白运输至足腹沟中,自组装成足丝进行黏附。企鹅珍珠贝足部及足丝中均发现能够修饰DOPA的酪氨酸酶。足部DEPs主要定位于细胞外区域且足丝中的31种蛋白有7种来自于细胞外基质(ECM),足丝蛋白中存在与足丝自卫相关的蛋白酶抑制剂及CD109抗原。研究结果促进对企鹅珍珠贝足丝分泌过程的了解,丰富了对双壳贝类足丝蛋白质成分的研究。3.模拟企鹅珍珠贝栖息地冬季(21℃)和夏季(27℃)水温,对正在分泌足丝足部(WB)和实验中未分泌足丝足部(NB)进行转录组测序结合多酚氧化酶(PPO)活力及活性氧(ROS)测定,探究企鹅珍珠贝足丝形成的可能机制。结果表明,PPO是足丝形成的关键酶,夏季PPO活力高于冬季,但无显著性差异。夏季足内活性氧(ROS)水平同样高于冬季,无显著性差异。经转录组分析共获得28442个基因,在WB21 vs NB21和WB27 vs NB27两个比较组中分别有1100和2573个基因被确定为差异表达基因(DEGs)。通过对两比较组进行GO和KEGG富集分析发现,差异基因在蛋白质正确折叠相关的内质网(ER)和内质网蛋白质加工中均有富集,HSP70出现上调和下调两种变化,泛素蛋白连接酶基因(E2、E3 ubiquitin-protein ligases)表现出上调。此外,微管相关基因在27℃组中显著富集,驱动蛋白基因如(dynein、kinesin)在其中显著上调,这与蛋白质组结果一致。两比较组中的蛋白酶抑制剂相关基因均表达上调同样与蛋白质组结果一致。研究结果为了解企鹅珍珠贝足丝分泌的可能机制奠定前期基础。
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