目的:目前针对特发性肺纤维化（IPF）的治疗选择有限,治疗的目的仍以延缓疾病的进展,提高生活质量和延长生存期为主。中药复方在IPF的治疗中发挥了一定的作用,且毒副作用小,患者易于接受。因此,本项目在已有黄芪当归治疗IPF的基础研究及临床研究的基础上,基于符合中医整体观的思路出发,拟基于循证医学和生物信息学讨论黄芪当归药对治疗IPF的作用及机制,全面对黄芪当归药对治疗IPF的现代科学内涵从多角度进行系统初步探索。在整体全面角度探讨黄芪当归药对治疗IPF作用及机制,使将来进一步由面到点的基础研究更具科学内涵,为今后的实验研究和临床研究提供更深层次科学依据。方法:1.通过主要中英文数据库检索有关黄芪当归治疗IPF的随机对照实验（RCT）。根据纳入标准及排除标准,纳入符合标准的RCT进行系统评价。使用Jadad评分量表评估纳入研究的质量,并参考Cochrane偏倚风险评估工具评估纳入文献的偏倚风险。提取纳入RCT的结局指标,使用RevMan5.3软件进行系统评价及Meta分析。2.应用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）、UniProt数据库检索获取黄芪当归药对的活性化合物及活性靶基因。通过GeneCards数据库获得IPF疾病相关靶基因,将黄芪当归活性靶基因与IPF相关靶基因取交集,获取黄芪当归药对作用于IPF的靶基因。利用Cytoscape软件构建“中药-化合物-靶基因-疾病”网络,筛选关键化合物。利用STRING网站构建黄芪当归药对作用于IPF的靶基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络,筛选关键靶蛋白。利用DAVID数据库、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路数据库进行基因本体论（GO）功能富集分析及KEGG通路富集分析。3.检索基因表达综合数据库（GEO）中包含IPF组织样本与正常组织样本的微阵列数据集,比较获得差异表达基因（DEG）。从TCMSP确定黄芪当归的活性化合物和活性靶基因。将DEG与活性靶基因取交集,利用Cytoscape软件建立“中药-化合物-靶基因”网络和PPI网络。利用RGUI软件及其软件包进行GO功能富集以及KEGG通路富集分析。构建黄芪当归药对治疗IPF的“基因-通路”网络。使用AutoDockTools软件和AutoDock Vina软件对目标蛋白受体及其相应的化合物进行分子模拟对接。4.建立博来霉素诱导的IPF小鼠模型,分为空白组、模型组、当归补血汤治疗组以及醋酸泼尼松阳性对照组。采用苏木精-伊红（HE）染色法观察各组间的病理变化,马松（Masson）染色评估肺纤维化程度。检测各组肺组织中羟脯氨酸的含量来量化肺纤维化的程度。通过免疫组化染色检测肺组织中炎症特异性的核因子κB（NF-κB）p65以及纤维化标志物Ⅰ型胶原;免疫荧光染色检测肺组织白细胞表面标记物CD45以及巨噬细胞细胞表面标记物F4/80。5.检索GEO数据库中的微小RNA（miRNA）数据集筛选IPF组织中与正常组织相比的差异表达miRNA（DE-miRNA）,通过miRNet平台预测DE-miRNA的下游靶基因。通过检索分析GEO数据库中IPF相关的信使RNA（mRNA）数据集,获得IPF组织和正常组织之间差异表达mRNA（DE-mRNA）。对DE-miRNA的预测靶基因和DE-mRNA取交集基因,鉴定IPF相关DE-miRNA的靶基因,利用Enrichr数据库进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。从TCMSP数据库确定黄芪当归的活性化合物和活性靶基因,将黄芪当归的活性靶基因与IPF相关DE-miRNA的靶基因取交集基因,确定黄芪当归作用于IPF的靶基因,由此确定黄芪当归药对作用于IPF的miRNA-mRNA调控网络。通过博来霉素诱导的IPF小鼠模型及实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）验证相关的miRNA-mRNA轴。结果:1.共有17项RCT纳入系统评价。使用Jadad评分量表评估了纳入研究的质量,参考Cochrane偏倚风险评估工具评估了纳入文献的偏倚风险。提取了纳入RCT的主要结局指标,使用RevMan5.3软件进行了 Meta分析。Meta分析结果显示,治疗组临床疗效总有效率和中医证候有效率显著高于对照组,差异有统计学意义;治疗组用力肺活量（FVC）、FVC占预计值的百分比（%预测值）、肺总量（TCL）%预测值、肺一氧化碳弥散量（DLCO）和DLCO%预测值显著高于对照组,差异有统计学意义;治疗组6分钟步行距离（6MWD）高于对照组,差异有统计学意义;治疗组Borg量表评分低于对照组,差异有统计学意义;治疗组不良反应发生率显著低于对照组,差异有统计学意义;治疗组咳嗽、喘息、气短、疲劳、口渴、舌苔、脉象等单项中医证候积分显著低于对照组,差异有统计学意义。2.利用TCMSP、UniProt数据库获得了 22种黄芪当归药对的活性化合物及100个活性靶基因。通过GeneCards数据库获得了 2232个IPF相关靶基因,将黄芪当归活性靶基因与IPF相关靶基因取交集,获得69个交集基因被认为是黄芪当归药对作用于IPF的靶基因,对应黄芪当归药对作用于IPF的17种活性化合物。利用Cytoscape软件构建了“中药-化合物-靶基因-疾病”网络,筛选出关键化合物为槲皮素、山奈酚、异鼠李素、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、刺芒柄花素、β-谷甾醇、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香碗豆紫檀酚以及毛蕊异黄酮。利用STRING网站构建了交集基因的PPI网络,筛选出关键靶蛋白为 IL6、VEGFA、MAPK8、CASP3、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、FOS以及AR。GO功能富集分析显示,黄芪当归药对治疗IPF的靶基因功能富集主要富集于DNA结合转录激活因子活性/特异性RNA聚合酶Ⅱ、核受体活性、转录因子活性/直接配体调控序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、蛋白质异质二聚体活性等功能;KEGG通路富集显示黄芪当归药对治疗IPF的靶基因通路富集主要包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染、乙型肝炎、人巨细胞病毒（HCMV）感染、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物（AGE）及其受体（RAGE）信号通路、癌症中的蛋白聚醣等通路。3.检索了 GEO数据库包含IPF组织样本与正常组织样本相比的DEG的微阵列数据集,通过对GSE2052、GSE21369、GSE24206以及GSE53845的分析,最终确定了1566个DEG,这些DEG被确定为的IPF相关基因。从TCMSP平台确定了黄芪当归的22种活性化合物以及196个活性靶基因,将DEG与活性靶基因取交集,40个交集基因被认为是黄芪当归药对作用于IPF的靶基因。建立“中药-化合物-靶基因”网络和PPI网络,确定了关键化合物为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、刺芒柄花素、β-谷甾醇等;关键靶蛋白包括NTRK1、MYC、CUL3、FN1、TP53、VCAM1、MCM2、ITGA4、ESR1、APP、CDK2、EGFR、CUL7、COPS5、CUL1 等。对黄芪当归药对作用于IPF的靶基因进行GO功能富集以及KEGG通路富集分析,构建了黄芪当归治疗IPF的“基因-通路”网络,对主要通路以及潜在热点通路进行梳理。最后,通过模拟分子对接初步验证关键化合物与其靶蛋白之间的潜在相互作用。4.建立了博来霉素诱导的IPF小鼠模型,HE染色结果显示,第14天表现为不同程度的肺充血、肺气肿、炎症细胞浸润;治疗组的肺充血和肺气肿程度较低,炎症细胞浸润水平较低,治疗组第21天,肺部炎症逐渐消退,炎症细胞浸润明显低于模型组。模型组在第14天出现肺泡结构受损、肺间质增生,第21天可见明显肺泡扩张;治疗组在第14天肺泡结构有所保留,肺间质增生被抑制,在第21天可见肺泡扩张,但较模型组轻微。Masson染色结果显示,模型组在第14天的肺组织中有胶原纤维沉积,第21天大量染色成蓝色的胶原纤维沉积在肺间质中;治疗组在第14天和第21天观察到轻度的肺纤维化。肺组织中羟脯氨酸的含量检测,与空白组相比,模型组的肺组织中羟脯氨酸的含量明显升高;与模型组相比,治疗组和阳性对照组的肺组织中羟脯氨酸的含量均显著降低。免疫组化染色结果显示,与空白组相比,博来霉素诱导的IPF小鼠,NF-κB p65的表达显著增加,尤其是IPF模型组与治疗组、阳性对照组比较尤为明显;模型组在细胞核中的表达强度高于当归补血汤治疗组。与空白组相比,博来霉素诱导的IPF,Ⅰ型胶原蛋白的表达显著增加;当归补血汤抑制了 Ⅰ型胶原的表达,降低了肺组织中胶原的沉积。免疫荧光染色结果显示,模型组白细胞及巨噬细胞浸润明显增加,当归补血汤和醋酸泼尼松治疗可减少肺组织炎症细胞的积聚。5.通过GEO数据库miRNA数据集筛选了 IPF组织中与正常组织相比的DE-miRNA,通过miRNet平台预测了 DE-miRNA的下游靶基因。通过分析GEO数据库IPF相关的mRNA数据集,同样获得了 IPF组织和正常组织之间的DE-mRNA。然后,确定了 IPF相关DE-miRNA的靶基因,并进行了 GO功能富集和KEGG通路富集分析。通过TCMSP数据库确定黄芪当归的22种活性化合物和196个活性靶基因,将黄芪当归的196个活性靶基因与49个IPF相关上调DE-miRNA的靶基因和53个IPF相关下调DE-miRNA的靶基因相交,确定出6个黄芪当归作用于IPF的下调靶基因和6个黄芪当归作用于IPF的上调靶基因。由此确定了黄芪当归药对作用于IPF的miRNA-mRNA 调控网络,包括上调 miRNA 与下调基因调控网络miR-654-3p-PKIA/ADRB1、miR-493-5p-FOS/OLR1、miR-410-3p/miR-495-3p-VEGFA 和miR-493p-3p-MAP2;下 调 miRNA 与 上 调 基 因 调 控 网 络miR-338-3p-MMP2/HIF1A/MMP9 和 miR-203a-3p-TOP2A/MMP1/TP63。最后,通过复制博来霉素诱导的IPF小鼠及当归补血汤干预模型及qRT-PCR验证了相关的miRNA-mRNA轴。结果显示,IPF模型组与对照组比较,mir-493表达显著升高,Olr1表达显著降低;mir-338表达显著降低,Hif1a表达显著升高。此外,当归补血汤治疗组与模型组比较,mir-493表达显著降低,Olr1显著升高;mir-338表达显著升高,Hif1a表达显著降低。结论:本项目从循证医学角度寻找目前使用黄芪当归药对治疗IPF患者的有效性和安全性的循证医学证据,揭示了黄芪当归药对临床治疗IPF患者安全有效,有利于患者的肺功能和运动耐量,可以改善患者的症状。使得黄芪当归药对临床应用治疗IPF更具现代科学内涵,可为进一步的RCT及真实世界研究提供参考,为进一步深入的基础实验机制研究提供临床疗效依据。本项目从整体角度对黄芪当归药对治疗IPF的作用机制通过生物学网络节点的连接和关系分析“化合物-靶点-通路-疾病”的多层次网络,从整体角度阐明黄芪当归药对治疗IPF多成分、多靶点和多通路的作用机制。同时进一步结合网络药理学和系统生物信息学方法,通过微阵列数据集分析鉴定IPF样本和正常样本之间的DEG,更加精准的揭示了黄芪当归药对作用于IPF的靶基因、靶蛋白和通路之间的关系,建立了“基因-通路”网络,通过分子模拟对接方法完成初步的分子对接验证,进一步为黄芪当归药对治疗IPF的基础研究提供可靠价值、提供思路、指明方向。本项目在整体角度阐明黄芪当归治疗IPF多成分、多靶点和多通路的作用机制,建立了“基因-通路”网络的基础上,获得了黄芪当归药对治疗IPF的重要通路,并进行进一步探索,在整体研究的基础上,对NF-κB相关通路以及miRNA相关通路进行了初步研究。NF-κB相关通路方面,在博来霉素诱导的IPF小鼠模型中进一步探讨黄芪当归药对通过干预NF-κB和巨噬细胞激活,发挥抗炎作用从而缓解肺纤维化的作用机制,为深入研究提供基础及依据。MiRNA相关通路方面,揭示了 miRNA-mRNA调控轴在IPF发病机制中的潜在机制,建立了黄芪当归药对可以改善IPF的miRNA-mRNA调控网络,并对部分miRNA-mRNA轴进行了实验验证,可通过实验进一步研究深入机制,并且可进一步完成黄芪当归药对中通过miRNA-mRNA调控网络作用于IPF的潜在化合物的药效物质基础研究。综上所述,基于循证医学和生物信息学探讨黄芪当归药对治疗IPF的作用及机制。从循证医学角度寻找目前使用黄芪当归药对治疗IPF患者的有效性和安全性的循证医学证据,临床角度探究黄芪当归药对治疗IPF科学内涵。结合生物信息学、网络药理学方法、分子对接方法整体角度阐明黄芪当归治疗IPF多成分、多靶点和多通路的作用,科学探索黄芪当归药对治疗IPF的重要通路。在整体研究的基础上,抓住主要的研究点,对NF-κB相关通路以及miRNA相关通路进行了初步科学探索。本项目围绕黄芪当归药对治疗IPF展开了系列研究,使其更具有现代科学内涵,更符合中药研究的国际化,更好地科学开发推广。