杧果ISSR标记及其优良单株的早期鉴定

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杧果是世界五大热带水果之一,也是我国著名的热带水果。为了弄清我国杧果主栽品种及地方品种的亲缘关系,探索早期快速鉴定优良单株的方法。本论文选用一种简便、快速、可靠的分子标记——ISSR技术,探讨其在杧果的亲缘关系、遗传多样性、品种鉴定以及在杧果炭疽病和生理病害早期鉴定中的应用。主要研究结果如下:1、改良了杧果基因组DNA的提取方法,提取出的杧果基因组DNA质量高,适合于ISSR扩增;叶绿体DNA的提取是采用先提取叶绿体,再经过蔗糖梯度(70%.60%.45%.30%.)纯化,然后采用CTAB法裂解叶绿体得到高纯度的叶绿体DNA。2、优化了适于杧果属植物ISSR扩增的反应体系和反应程序:总体积20μL,10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.25μmol/L primer,1 Ur Taq polymerase(Takara Biotechnology,Japan),60ng DNA。扩增反应的程序:94℃5min预变性;94′C 1min,47℃—53℃(叶绿体DNA是50℃-55℃)1min,72℃2min,40个循环;72℃延伸10min。3、从120条ISSR引物中筛选出20条条带清晰、多态性丰富的引物用于基因组DNA扩增;从50条ISSR引物中筛选出8条适合于叶绿体DNA扩增的引物,其中有7条是基因组DNA和叶绿体DNA共有的引物。4、从30个引物中筛选出6个多态性好的ISSR引物建立DNA指纹图谱用于区分吕宋杧品种(系)。分析DNA指纹图谱,发现这6个引物中每个引物都能区分吕宋系列品种(系),吕宋杧和其它供试的7个品种(系)同源性低,而这7个品种(系):高州吕宋杧、湛江吕宋杧、田阳香杧、金钱杧、柳州吕宋杧、粤西一号、攀西红吕宋同源性较高,可归为一类。表明ISSR—PCR技术对杧果品种(系)的鉴定非常有效,能区分亲缘关系很近的品种(系)。5、以38个杧果栽培种、扁桃、冬杧为试材,并从42个ISSR引物中筛选出9个多态性好的引物进行ISSR—PCR研究,聚类分析发现所有供试的23个广西地方品种与秋杧、马切苏杧、象牙杧和爱文杧归为一个大类,而且广西本地杧果品种之间的亲缘关系较近。6、对广西农科院果树资源圃的33个杧果品种和2个近缘种扁桃、冬杧分别进行基因组DNA和叶绿体DNA ISSR分析。选出多态性好的7个ISSR共有引物,用UPGMA进行聚类分析,若以0.73为相似系数分界点,叶绿体DNA ISSR把35个样品分为四类,而基因组DNA-ISSR将35个样品归为二类。虽然叶绿体DNA ISSR比基因组DNA ISSR扩增的条带数少,但是它的多态性比率却高于基因组ISSR(79.4%vs 70.7%)。在杧果亲缘关系分析上,叶绿体DNA ISSR分析优于基因组DNA ISSR分析。7、利用ISSR技术鉴别杧果生理病害。从42条ISSR引物中选用9条引物,对20个杧果样品进行ISSR—PCR研究,探讨其与果实生理病害关系。结果表明:20个杧果品种聚类为两组,8个患果实生理病害的品种聚类为一组,12个不表现果实生理病害的品种聚类为另一组。根据这一结果,可利用这9条引物对杧果品种是否易患生理病害进行早期初步鉴定。8、利用ISSR技术鉴别杧果炭疽病。从120条ISSR引物中选用8个ISSR的引物,对台农一号、水英达、爱文、海顿等20个杧果品种进行炭疽病抗病性分析,结果显示ISS—PCR聚类关系与杧果炭疽病的抗性有很大的相关性,表明ISSR技术可作为早期鉴定杧果炭疽病抗性的一种方法
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