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结核病(tuberculosis，简称TB)严重影响人类健康潜伏期感染是其化疗疗程偏长、疗效不佳及化疗后再次复发的主要原因，也是结核病控制形势严峻的主要因素之一。分枝菌酸(mycolic acid)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的重要组分之一，其分布和精美的结构决定着结核分枝杆菌在敌对的环境中受保护的程度。鉴于前人所做的工作，目前比较一致的意见是：与结核分枝杆菌细胞壁合成相关的酶类，尤其是与脂肪酸合成和降解相关的酶类是筛选抗结核杆菌药物的理想靶标。烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase，echA，EC4.2.1.17)是结核分枝杆菌的分枝菌酸代谢中的一个关键酶，它不仅参与脂肪酸的β-氧化，还与赖氨酸降解、异亮氨酸降解、缬氨酸降解，以及色氨酸代谢、β-丙氨酸代谢相关。根据GenBank登录的H37Rv echA18基因片段(GeneID：888123)设计一对特异性的引物，以H37Rv基因组为模板，热启动PCR方法扩增echA18基因序列，经乙酸铵方法纯化扩增产物，酶切PCR产物和pET32a(+)，将扩增的片段连入pET32a(+)，克隆至原核表达载体之后，将重组质粒转化入宿主菌大肠杆菌DH5α中；通过菌落PCR、酶切重组质粒和测序鉴定重组质粒。将鉴定正确的重组质粒pET32a-echA18(+)转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，12％SDS-PAGE检测重组蛋白的表达量。以温度、时间和IPTG的浓度为参数对蛋白的诱导条件进行了优化，经过Bio-Rad凝胶成像系统分析重组蛋白的表达量。根据可溶性重组蛋白的表达量比较大的条件大量诱导，超声破碎，Ni Sepharose纯化可溶性重组蛋白。用Bradford法测定收集的目的蛋白浓度，剩余目的蛋白经透析、冻干后，-20℃保存。纯化的重组蛋白用圆二色谱仪J-810测其重组蛋白的二级结构，与预测的结核分枝杆菌echA18的二级结构相比较。利用DNASTAR、Vector NTI 9.0、SignalP等生物信息学平台对结核分枝杆菌echA18进行一级结构、功能位点、信号肽、亲／疏水性及跨膜结构等进行分析。在数据库(http://www.ExPaSy.org/)上搜索氨基酸序列同源性大于30％的蛋白晶体结构，确定三级结构模板，对酶的三级结构同源建模。通过SWISS-MODEL建模网站搜索的小鼠烯酰辅酶A水合酶的晶体结构是最佳模板ley3A，模建人型结核分枝杆菌echA18的三维结构；由于牛型结核分枝杆菌echA18与H37Rv中的echA18(烯酰辅酶A水合酶N-端)和echA18’(烯酰辅酶A水合酶C-端)的氨基酸序列100％同源，以小鼠的dub2B为模板对牛型结核分枝杆菌echA18进行建模。通过比较所建的两个模型，发现它们的立体结构相似，都形成了一个Loop结构。在结核分枝杆菌中，参与脂肪酸代谢的酶或蛋白大约有250类，烯酰辅酶A水合酶又是表达量比较高的一类，以H37Rv echA18为中心，预测蛋白质相互作用网络，以全面了解它的代谢机制。结果显示重组echA18基因工程菌构建成功，纯化方案简单可行，得到的重组echA18纯度达到80％以上。实验测得的二级结构与网上预测的基本一致，α-螺旋大约占32.86％，β-折叠15.96％，比例最大的是无规则卷曲51.17％。在预测的MTB echA18活性中心区IAAVRGLAVGGGCELATACDV附近，序列相对保守。相应地，138～157位这一段保守序列所形成的α-螺旋，是保守的跨膜区域，与模建的3D相比较发现，这一区域在三级结构上形成一个Loop结构。由于138～157位是跨膜区，推测活性位点可能疏水的。在整个结构中，1～137位膜内，157～213位在膜外；其中大的螺旋分别位于65～78位，116～131位，143～155位，181～199位氨基酸，折叠位于40～56位，84～96位等。蛋白质相互作用网络显示，在medium confidence为0.40情况下，echA18与其体内的17中物质有相互作用，17个nodes；如果在low confidence为0.15情况下进行预测，发现与H37Rv echA18相互作用的物种更多。