第一章FOXKl在结肠癌中的表达与临床相关性的研究目的和意义1、 FOXKl的结构特点FOX(叉头框)基因家族为一个转录因子家族,共包含43个成员。FOX蛋白家族1类包括FOXA-G, I-L以及Q亚家族,其在碳端有一个基本结构域；而FOXH以及FOXM-P则归属于FOX蛋白家族2类。在人的胚胎干细胞(ES)中检测到了FOXH1以及FOXO1的mRNA表达。在一些人类先天性疾病中也检测到了FOXC1、FOXC2、 FOXE1、 FOXE3、 FOXL2、 FOXN1、FOXP2和FOXP3等该家族基因的突变。本研究的研究对象为叉头框基因家族中的一员,FOXK1,其编码的蛋白与鼠肌细胞核因子(MNF)/FOXK1有高度的同源性。人FOXK1基因位于染色体7p22,包含13个外显子。研究发现FOXK1a和FOXK1b分别为FORK1的两个转录子,它们的5’端包含一个叉头结构。人FOXK1蛋白包括733个氨基酸,约75.5 kDa,其中88.7%的氨基酸与鼠FOXK1(719个氨基酸)相同,48.7%的氨基酸与人FOXK2相同,47.5%氨基酸与非洲蟾蜍FOXK2相同。在人FOXK1、 FOXK2、鼠FOXK1以及非洲蟾蜍FOXK2中FHA元件(叉头框相关元件)和FOX元件(叉头框元件)均为保守元件。2、 FOXK1与肿瘤的关系已有许多报道认为FOX转录因子家族与肿瘤以及胚胎形成有着密切的关系。FOXO3和FOXO4基因在血液系统恶性肿瘤中与MLL基因融合；FOXO1基因在横纹肌肉瘤中则与PAX3或PAX7基因融合。FOXA1基因在食管癌、胰腺癌以及肺癌中均过表达;而在胃肠道肿瘤中FOXP1基因表达缺失。这些FOX蛋白在细胞生长,增殖以及分化过程中都起了双相的调节作用。在结直肠癌、淋巴瘤和胶质母细胞瘤细胞系中,Akt作为P13K的下游调节子,可以通过磷酸化FOXO1、FOXO3以及FOXO4来激活细胞周期,从而有利于肿瘤细胞转化的过程；而去磷酸化的(活化的)FOXO1、FOXO3和FOXO4则转入细胞核中诱导细胞休眠或细胞凋亡。In silico检测分析253个胚胎及成人cDNA文库(每个文库包括5000个序列),有85个文库检测到FOXK1转录子表达。在胚胎及幼儿文库里,FOXK1主要表达于胎儿脑部,眼睛,心脏,肺,胸腺,幼儿脑部以及胚胎中。在55个成人组织文库里(33个肿瘤文库,18个正常组织文库),正常脑,结直肠,肾和肺组织未检测到FOXK1的表达,正常淋巴,眼睛以及皮肤中可表达；而这些器官对应的肿瘤组织中FOXK1均有表达,尤其在脑(95／0),结直肠(124／0)和淋巴结组织(120／24),肿瘤中FOXK1的表达远高于对应的正常组织,提示FOXK1为癌基因。FOXK1基因在肿瘤发病机制中的研究较少,在乳腺癌细胞的血管生成及转移过程中,FOXK1是以抑癌基因的角色存在。Freddie等发现在人骨肉瘤细胞中,FOXK1通过作用于SRF抑制平滑肌a-肌动蛋白的表达。Wang等报道了FOXK1、 FOXK2在结直肠癌组织、结直肠癌细胞(HT29、 DLD1)中高表达,通过抬高FOXK1、 FOXK2的表达,证实了FOXK1通过定位DVL蛋白入核从而激活Wnt信号通路。综合来看,FOXK1的在肿瘤中的研究限于乳腺癌、骨肉瘤、结直肠癌；在人体多器官肿瘤的表达情况多见于In silico中的生物信息分析。而在肠癌的研究中,对FOXK1的研究数据提示其为癌基因,是通过激活DVL蛋白激活Wnt通路而发挥癌基因的作用,对于FOXK1表达状况与临床患者的预后相关性、生存率的关系、肿瘤患者各类临床特点(如年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、是否有淋巴结转移)的关系的研究几乎没有报道,这就成为本课题研究的第一个切入点,我们将分析FOXK1蛋白的表达情况对患者临床特点的关系,找出其作为癌基因与肠癌患者生存率是否存在相关性的可能。本课题此章节,以组织芯片、免疫组化、Western、qRT-PCR、稳定表达株构建技术、双荧光素酶基因报告检测系统、生存分析等实验手段。对FOXK1的人体肿瘤组织(包括结直肠癌)中表达情况进行具体检测,进一步证实FOXK1在结直肠癌中癌基因的作用。围绕FOXK1在结肠肿瘤中的表达强弱及其与临床特点、生存率的关系进行探讨,继而为结肠癌的基因治疗提供帮助。主要材料组织与细胞：组织芯片(15种人体正常与肿瘤组织),93例结直肠癌及癌旁组织,FHC、SW480、LOVO、SW1116、Colo205、 SW620、 HT29和DLD1细胞。试剂：RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、免疫组织化学相关试剂盒、兔抗人FOXK1单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体。主要方法1、 FOXK1在15类正常及肿瘤组织中的表达情况将嵌有15类(每类3例)正常组织的芯片及15类(每类3例)对应肿瘤组织的芯片(皮肤、睾丸、肾脏、卵巢、前列腺、肺、食管、胰腺、宫颈、大脑、胃、小肠、乳腺、结肠、直肠)进行免疫组织化学染色,探讨FOXK1在正常组织及肿瘤组织中的表达情况。2、 FOXKl在结直肠癌组织及细胞中的表达情况2.1 FOXK1在原发性结肠癌组织中的表达情况收集9例来自不同结直肠癌患者手术标本,提取组织蛋白,进行western blotting,比较FOXK1在肿瘤组织及配对癌旁组织中表达的差异。2.2 FOXK1在7个结直肠癌细胞系中的表达情况提取7个结直肠癌细胞系(HT-29, SW480, LoVo, SW1116, SW620, Colo205和DLD1)和人正常结直肠上皮细胞FHC细胞的的细胞总蛋白,利用Western blotting技术检测FOXK1在结直肠癌细胞内的表达情况。3、过表达FOXK1对结直肠癌细胞内癌基因表达的影响3.1构建过表达FOXK1的稳定细胞株将质粒pcDNA3.1-FOXK1和对照pcDNA3.1质粒瞬时转染到SW480细胞,48小时后用含有1000μg/ml的G418培养基连续培养2周,挑选单克隆细胞株,消化至单个细胞并接种至96孔板内,继续以1000μg/ml的G418培养基连续培养两周,得到单克隆稳定表达株,并以Western blotting及qRT-PCR进行验证单克隆株是否高表达FOXK1基因。3.2过表达FOXK1后对癌基因在mRNA表达水平的影响提取两组细胞：pcDNA3.1-FOXK1-SW480和对照pcDNA3.1-SW480的细胞总RNA,逆转录获得mRNA后进行qRT-PCR,比较FOXK1表达变化对癌基因Survivin、Cyclin D1和AP-1在mRNA表达水平的影响。3.3过表达FOXK1后对癌基因的转录活性的影响分别构建以PGL3为载体的,含有Survivin, Cyclin D1和AP-1启动子片段的双荧光素酶报告基因质粒,pluc340、pluc416和pluc450,瞬时转染入pcDNA3.1-FOXK1-SW480和对照pcDNA3.1-SW480两组结直肠癌细胞,评价FOXK1过表达对上述3个癌基因转录活性的影响。4、FOXK1在结直肠癌组织中的表达与临床特点及预后的关系收集93例肠癌患者手术标本经福尔马林固定、石蜡包埋并切片,进行免疫组织化学染色,根据FOXK1表达情况分为高表达组及低表达组,分析FOXK1的表达情况与年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、病理分化程度、淋巴结转移情况的相关性,通过绘制Kaplan-Meier生存曲线来表现FOXK1表达情况对总体生存率的影响。5、数据的统计学处理双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR结果用三或两次实验结果先进行方差齐性检验,方差齐(P>0.05)则进行两个处理组间独立样本t检验或多个处理组间one way ANOVA统计分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用LSD法；方差不齐(P<0.05)则应用Satterthwaite近似t检验或Welch检验分析,整体比较有显著性差异后多重比较采用Duunett’s T3检验。通过免疫组织化学的得分判断FOXK1的表达高低与临床病理(多个处理组)特点运用两样本率比较采用四格表资料的χ2检验,多样本率的比较采用行列表资料的x2检验,如果某一个分组的样本特别小,相关性分析则采用Fisher’s精确检验,生存分析方法采用log-rank检验。分析与生存相关的指标有：性别(男/女),年龄(