间隙连接通道（gap junctional channels）是相邻细胞之间直接进行小分子物质（分子量＜1000 Da，例如，离子、代谢产物和信使分子等）交换的通道。生物体通过这种通道进行物质和信息交换，使得细胞对环境的刺激作出协调一致的反应。Connexin 31（Cx31）是β属间隙连接蛋白，突变可导致皮肤病、神经性耳聋及周围神经病，一个基因的不同突变导致完全不相关的三种疾病的致病模式引起了许多研究者的关注，然而至今对其突变的致病机制知之甚少。报道认为许多与间隙连接蛋白突变相关的遗传性疾病是由于这些间隙连接蛋白的新陈代谢周期改变所致。较之其它间隙连接蛋白，Cx31具有相对较长的半衰期，通过蛋白酶体和溶酶体两条途径降解，那么Cx31的致病突变的降解途径和新陈代谢周期是否发生改变?而这些改变是否与疾病的致病机制相关呢?为了探明这种疑问，我们将Cx31野生型、耳聋及皮肤病相关的突变体分别克隆入pEGFP-N1质粒中形成的融合基因转染hela细胞，建立稳定表达细胞系来研究它们的降解和代谢途径的差异。对于认为可能导致hela细胞死亡的EKV相关突变体，采用转染不传代的方法筛选克隆，其他按常规方法操作。建立了Cx31野生型、4个耳聋相关突变（141delI，I141V，R180X，E183K）和4个皮肤病相关突变（G12D，L34P，R42P，F137L）的稳定表达系。采用特异的蛋白酶抑制剂分别抑制蛋白酶体和溶酶体活性，通过荧光定位和Western Blot分析抑制前后细胞内Cx31含量的变化，来研究Cx31野生型及各突变体降解途径的差异及蛋白代谢的变化。1)荧光显微镜观察发现：蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制CLQ作用10小时，可促使EKV相关突变体荧光显著增强，延长前者的作用时间，能使这些突变体出现临核荧光聚集，显性EKV相关突变体细胞膜上有时会出现少量间隙连接斑，其它溶酶体抑制剂NH₄CL、E64、Leu对EKV相关突变体作用不大。Cx31野生型和耳聋突变体（141delI，I141V，E183K）在上述抑制剂的作用下，荧光强度变化不大，但会出现对之敏感的特征性指标：细胞质中分别会“囊泡样”和“煎饼样”荧光物质增加。耳聋突变体R180X则对所有抑制剂都敏感。2) Western Blot结果出现下面四种情况：①经蛋白酶体及不同溶酶体抑制剂处理10小时后，影响不大，包括较低表达的野生型及耳聋相关突变体（141delI／Cx31、I141V／Cx31、E183K／Cx31）。②蛋白酶体抑制剂MG132及溶酶体抑制剂CLQ抑制后，蛋白表达量显著增高，其他溶酶体抑制剂抑制后，蛋白量变化不明显，这些突变体包括EKV相关的突变体L34P／Cx31、F137L／Cx31。③蛋白酶体抑制剂MG132抑制后，蛋白表达量显著增高；溶酶体抑制剂抑制后，蛋白量变化不明显，这些包括EKV相关的突变体G12D／Cx31、R42P／Cx31。④蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂NH₄CL、CLQ抑制后，蛋白表达量显著增高，溶酶体抑制剂E64、Leu也可使其蛋白表达量增高，但蛋白酶体抑制剂MG132抑制后，蛋白量增加更明显，包括高表达的野生型细胞系及耳聋相关突变体R180X／Cx31。⑤表达量不同的野生型细胞系对于抑制剂的反应有所不同，可能是过表达的新生蛋白的干扰。在过表达的克隆中加入各种蛋白酶抑制剂同时加入蛋白合成抑制剂CHX。结果显示经这种处理后，MG132、NH₄CL、CLQ使野生型Cx31蛋白增加量差不多。上述结果显示：在Cx31的降解途径中，蛋白酶体和溶酶体扮演不同的角色，蛋白酶体负责新生蛋白、错误折叠蛋白及一部分成熟蛋白的降解，溶酶体主要负责较成熟蛋白的降解；EKV相关突变及耳聋突变R180X／Cx31大大加快了蛋白的半衰期，而其它耳聋突变对半衰期的影响不大。说明Cx31突变导致不同的疾病与其降解和代谢具有相关性。研究Cx31野生型及疾病相关突变的降解途径中发现，EKV相关突变体在MG132的作用下，临核位置出现类似aggresome样的荧光聚集物，许多报道认为aggresome样蛋白聚集物是一些遗传性疾病的特征性指标，可能与这些疾病的致病机制相关。为了验证EKV相关突变体在MG132的作用下形成的荧光聚集物是否就是aggresome，探明这类疾病的致病机制，我们用与aggresome相关的一些特征性指标（如聚集物与热休克蛋白、泛素蛋白的共定位、中间纤维的塌陷以及聚集物能否被BFA或NOC逆转。）来加以证实。荧光显微镜下观察发现：①热休克蛋白Hsp70c、泛素蛋白Ubiquitin在荧光聚集物处呈现高表达，有时Hsp70c形成笼形结构环绕荧光聚集物，②hela细胞中间纤维Vimentin塌陷，与荧光聚集物共定位。③阻止蛋白由内质网向高尔基体运输的药物BFA不能逆转荧光聚集物的形成，而破坏微管的药物NOC，可以逆转荧光聚集。上述结果显示：MG132的作用下，EKV相关突变体临核位置出现的荧光聚集物，就是aggresome，提示Cx31突变导致的皮肤病，可能与这些突变蛋白由于降解异常而形成aggresome相关。一些折叠、运输障碍的蛋白，通过低温诱导，可以恢复它的功能；对于这些有“温度依赖性”表达特征的蛋白，一些化学分子伴侣（如甘油、三甲酰胺）也具有相同的作用。Cx31皮肤病相关突变通过蛋白酶体迅速降解的原因，可能就是这些蛋白的错误折叠启动了蛋白质合成的质量控制程序，被内质网介导的蛋白酶体降解，因此对于这些突变，也可能通过上述措施恢复其功能。为了探究皮肤病相关Cx31突变的致病机制，提供这类疾病治疗的理论依据和可行性，我们分别采用低温培养或加入化学分子伴侣的方法，通过荧光观察、Western blot及染料转移实验，检测这些致病突变细胞系中荧光分布、间隙连接斑的形成、蛋白表达变化、及是否形成功能性的间隙连接通道。观察发现：①Cx31显性EKV相关突变体在低温或化学分子伴侣（甘油、三甲酰胺）作用下，能够形成间隙连接通道，染料转移实验显示这些通道是有功能的。隐性EKV相关突变L34P未发现间隙连接斑的出现，但荧光强度增加，且随着作用时间的延长，细胞质中囊泡样荧光向远端分泌途径分布。Cx31野生型表现为细胞间较大的间隙连接斑增加。②低温促使Cx31野生型及皮肤病相关突变的蛋白表达量增加，皮肤病相关突变是因为促进了成熟蛋白的增加。以上这些结果显示：低温诱导和化学分子伴侣可以恢复显性EKV相关突变功能，帮助隐性EKV突变组装，但不能确定是否可以恢复它的部分功能。总之，上述结果表明：Cx31致皮肤病相关突变降解的异常及蛋白代谢周期改变，提示这类突变由于折叠或初期寡聚化异常，启动内质网介导的蛋白酶体降解途径，当这些突变蛋白量超过蛋白酶体的负荷能力时，这些突变蛋白形成aggresome样物质沉积在邻核位置，这可能是与这类疾病的致病机理相关。冷休克和化学分子伴侣可恢复EKV相关突变的功能，一方面为明确这类疾病的致病机制提供了可靠依据，另一方面为它的治疗方案的设计提供了有力帮助。