木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,其主要成分包括纤维素和各类半纤维素,如甘露聚糖和木聚糖等。通过糖苷水解酶,如纤维素酶,甘露聚糖酶和木聚糖酶催化降解,这些多糖成分可以被水解成可溶性糖,经过生物炼制可以转化为生物燃料和多种化工制品,这为解决当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。显然,获得适用于特定工业环境的不同种类的糖苷水解酶是降低工业生产成本,加快木质纤维素转化的关键。虽然糖苷水解酶设计工作已经有很多成功的先例,但对它们的活性架构和催化过程分子机制的认识尚不深入。本文基于结构生物信息学方法,对GH5主要亚家族的纤维素酶和甘露聚糖酶进行了序列、结构和分子动态等方面的分析,定位了活性架构中与底物特异性相关的关键氨基酸残基,并对TfCe15A活性中心残基进行了丙氨酸筛选及功能分析,初步阐明GH5家族酶分子不同亚位点关键残基在酶催化中发挥的不同功能,为进一步的酶分子设计奠定了基础。本文的主要内容如下:1.通过对糖苷水解酶GH5家族中6个主要亚家族酶分子的结构生物信息学分析,阐明了不同亚家族酶分子间的主要异同点。对GH5家族主要亚家族序列、结构和分子动态分析显示,不同亚家族酶分子的主要差异存在于构成活性架构的8个loop 区域。比较不同亚家族活性中心序列谱发现,GH5家族酶分子负亚位点残基保守度最高,-1亚位点有3个残基在整个GH5家族内是完全保守的,一2亚位点也有一个色氨酸在GH5家族内完全保守,这些残基可能与催化断键密切相关;还有部分残基在单个亚家族内保守或相对保守,这些残基可能与不同亚家族之间的功能演化相关。2.通过对GH5₂亚家族纤维素酶和GH5₈甘露聚糖酶的结构分析和生化测定,发现了活性架构-1和-2亚位点关键残基在两个亚位点不同的底物识别机制。由于纤维素和甘露聚糖底物-1亚位点糖环不同程度的扭曲,在该亚位点两类底物O3空间位置存在差异,而在-2亚位点,纤维素和甘露聚糖差异在于O2的空间位置。相应地,结构比对结果显示,在-1亚位点,两个亚家族保守的组氨酸和天冬酰胺通过与-1O3的相互作用起到底物识别作用,而在-2亚位点,GH5 2亚家族相对保守的谷氨酸通过与-2O2的相互作用起到底物识别作用。3.通过对TfCe15A所有活性中心氨基酸残基的丙氨酸筛选及生化测定,揭示了活性中心残基在酶催化过程中发挥的不同作用。对TfCel5A活性中心共22个关键氨基酸进行了丙氨酸突变及结合常数Ka和酶活测定,并分析了关键残基在酶催化中发挥的功能。Ka测定结果显示,负亚位点残基在底物结合中至关重要,其中-2亚位点保守的色氨酸和-2/-3亚位点相对保守的带电残基对通过与底物-2/-3亚位点形成密集的氢键网络在底物初始结合中发挥了重要作用。酶活测定显示,-2到+1亚位点残基在催化断键中至关重要,其中与-1O2相互作用的保守组氨酸和酪氨酸通过稳定亲核试剂并维持其带电状态来协助催化断键;与-1O3相互作用的保守组氨酸和天冬酰胺通过与底物间的相互作用协助-1亚位点糖环的扭曲,该过程需要loop3较大幅度的运动;此外,-2和+1亚位点两个保守色氨酸也参与底物形变过程;根据相关残基在GH5家族中的高保守度可知,它们在催化断键中发挥的重要作用在整个GH5家族中是一致的。