目的:　　为研究大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ蛋白体内的铁结合活性以及铁结合对其拓扑异构酶活性的影响，在大肠杆菌体内诱导表达目的蛋白，在M9基础培养基中添加外源铁纯化得到铁结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ并测定其活性。并且利用定点突变技术探索铁的结合位点以及大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ各个锌指结构对其活性的影响，以及从DNA结合能力以及空间构象等角度较全面地阐述铁和锌对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调节作用研究　　方法:　　1.大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的铁结合能力及其对活性的影响　　1)铁结合对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的抑制作用　　构建大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的表达载体pET28b-E.coli TopA，并转入大肠杆菌BL21菌株中，在LB培养基，以及不添加金属、添加外源铁和外源锌的M9培养基中用IPTG分别诱导表达蛋白。通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白并用紫外可见分光光度仪扫描蛋白样品波谱，测定样品铁、锌结合含量以及拓扑异构酶活性。为进一步证明过量的铁可以竞争锌对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的结合并抑制其活性，在诱导表达大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的M9培养基中加入固定量终浓度为0.15μM的硫酸锌，同时分别加入0，2，5，20μM浓度梯度的柠檬酸铁，纯化后测定各样品的铁、锌结合含量以及其拓扑异构酶活性。　　2)氧化还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调节作用　　在存在和不存在还原剂DTT的情况下，测定铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性，并且在和DTT孵育之后重新去掉DTT以观察氧化和还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的可逆性调节作用。同时从光谱学角度以及利用菲洛嗪作为游离铁的指示剂来验证铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的氧化还原性质以及氧化还原条件对铁和大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ结合的亲和力的影响。　　2.铁结合对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性调节作用的机制研究　　1)大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ铁结合位点的鉴定　　利用定点突变技术将大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ三个锌指结构中每个锌指结构的前两个半胱氨酸突变为丝氨酸，得到3个锌指结构的单突变体(ZM1-mut、ZM2-mut、ZM3-mut)和1个锌指结构的双突变体(ZM1/ZM2-mut)。将突变成功的pET表达载体转入大肠杆菌BL21菌株中，在添加外源铁的M9培养基中用IPTG分别诱导表达蛋白，利用上述研究野生型大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ体内铁结合活性一样的方法，分别比较各突变体的体内铁结合活性。此外为进一步验证铁的结合位点，利用定点技术分别构建大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的不同截短蛋白表达载体，包括N端催化结构域(TopA-N67)、删除第三个锌指结构的拓扑异构酶蛋白(TopA-ZM3-Del)以及第一个和第二个锌指结构组成的多肽(TopA-ZM1+ZM2)，利用上述研究野生型大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ体内铁结合活性一样的方法，分别比较各截短蛋白的体内铁结合活性。　　2)大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ三个锌指结构对酶活性的不同作用　　将上面构建的3个锌指结构的单突变体(ZM1-mut、ZM2-mut、ZM3-mut)和1个锌指结构的双突变体(ZM1/ZM2-mut)的pET表达载体转入大肠杆菌BL21菌株中，在添加外源铁和外源锌的M9培养基中用IPTG分别诱导表达蛋白，纯化后测定并比较各个锌结合的突变体蛋白以及铁结合突变体蛋白的体外拓扑异构酶活性。为验证体内的拓扑异构酶活性，对野生型菌株MC4100的topA基因进行敲除，得到topA-敲除菌株。同时重新构建和突变得到野生型拓扑异构酶Ⅰ和它3个锌指结构的单突变体(ZM1-mut、ZM2-mut、ZM3-mut)和1个锌指结构的双突变体(ZM1/ZM2-mut)的pBAD表达载体，转入topA-敲除菌株，在阿拉伯糖的诱导下观察野生型以及各锌指结构突变体蛋白对敲除菌株在低温生长缺陷的补偿作用，以间接比较各锌指结构突变体蛋白的体内活性。　　3)铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构域对DNA结合能力的影响　　将表达大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构的pET表达载体转入大肠杆菌BL21菌株中，在添加外源铁和外源锌的M9培养基中用IPTG分别诱导表达并纯化得到蛋白，利用带有荧光素标记的单链DNA，在琼脂糖凝胶电泳中直接比较铁结合和锌结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构域对其DNA的结合能力。　　4)铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ对其空间构象的影响　　分别诱导表达和纯化出铁结合和锌结合的野生型大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ，同时设立铁结合和锌结合的ZM1/ZM2-mut的对照。利用测定蛋白的内源性荧光强度的方法（280 nm为激发波长），间接反映铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ对其空间构象的影响。　　5)不同金属结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ对其活性的影响　　在培养和诱导表达野生型大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的M9基础培养基中分别加入50μM的外源钴、铜、镉等离子，分别纯化出各种金属离子结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ蛋白，用原子吸收光谱分别测定各种金属含量，并测定拓扑异构酶活性，以探究不同金属结合对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的影响。　　结果:　　1.大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的铁结合能力及其对活性的影响　　1)铁结合对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性具有抑制作用　　从LB培养基中过表达并得到纯化的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ，肉眼观察具有明显的红褐色，用紫外可见分光光度仪分析，在482 nm和563 nm处可见两个特异性的铁结合吸收峰。在不添加金属、添加外源铁以及添加外源锌的M9培养基中可分别纯化得到apo形式、铁结合形式以及锌结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ，金属含量测定得知铁结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ，每个蛋白分子约结合1个分子比例的铁离子。而且拓扑异构酶活性测定发现apo形式和铁结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ都没有活性，只有锌结合的蛋白酶具有较高的活性。而且细胞内过量的铁还可以和锌竞争对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的结合，从而抑制其拓扑异构酶活性。　　2)氧化还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调节作用　　原本没有拓扑异构酶活性的铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ在还原剂DTT存在的情况下，其活性得到恢复，而重新去除DTT后，其活性又被抑制。此外光谱学分析得知，诸多还原剂都能还原铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ，表现在特异性铁结合吸收峰的消失和减弱。并且大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ结合的铁离子被还原之后，其对蛋白的亲和力明显减弱。这种氧化还原条件对铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的调节作用是可逆的。　　2.铁结合对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性调节作用的机制研究　　1)大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ铁结合位点的鉴定　　当大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ第一个或第二个锌指结构被突变后，其特异性铁结合吸收峰基本消失，铁结合含量也明显下降。而且如果第一个和第二个锌指结构同时突变后，铁结合含量进一步降低。相比之下，第三个锌指结构突变后，铁含量没有任何减少。同时由第一个和第二个锌指结构组成的蛋白多肽，其本身具有相当强的铁结合能力。删除第三个锌指结构的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的铁结合含量没有任何降低。这些结果说明铁的结合位点是在第一个和第二个锌指结构，而与第三个锌指结构无关。　　2)大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ三个锌指结构对拓扑易购酶活性的不同作用　　体外实验中，当大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ第一个或第二个锌指结构被突变后，其锌结合蛋白的拓扑异构酶活性明显减弱，如果第一个和第二个锌指结构同时突变后就完全丧失了拓扑异构酶活性，但是第三个锌指结构突变后活性减弱程度相比之下较小。此外铁结合的野生型拓扑异构酶Ⅰ以及铁结合的各个锌指结构突变蛋白都没有拓扑异构酶活性。体内实验中，topA基因敲除后，菌株在37℃条件下生长状况无明显改变，但在低温(＜30℃)下生长速率显著受到抑制。将表达野生型大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的载体导入topA敲除菌后，其低温生长缺陷得到完全补偿。将各锌指结构突变体表达载体导入敲除菌后，第一个或第二个锌指结构的单突变体对敲除菌的生长缺陷有一定量的补偿作用，面第一个和第二个锌指结构的双突变体导入后则几乎不能补偿其生长缺陷，相比之下第三个锌指结构单突变体的导入则与野生型蛋白的导入比较类似，具有较为完整的补偿作用。　　3)铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构域对其DNA结合能力的影响　　Apo形式和铁结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构域肽段，其对单链DNA的结合能力都比锌结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构要相对较弱。　　4)铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ对其空间构象的影响　　铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ在相同的蛋白浓度和荧光测定条件下，其在280nm波长激发下，333 nm处的内源性发射荧光峰值比锌结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ要低25-30％。第一个和第二个锌指结构同时突变后，其无论结合锌还是铁，其内源性荧光强度也都比锌结合的野生型大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ低。　　5)不同金属结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ对其活性的影响　　在添加不同金属的M9基础培养基中分别诱导并纯化得到钴、镉、锌、铁、铜结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ，发现钴、镉、锌结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ具有较高的拓扑异构酶活性，而铁和铜结合的蛋白酶没有活性。利用原子吸收光谱测定金属含量，发现每个大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ分子在体内分别能够结合3个钴离子，3个镉离子和3个锌离子，而只能结合1个铁离子，以及结合非常少量的铜离子。　　结论:　　通过本课题，我们发现大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ不仅能够结合锌，还能够结合铁，而且铁结合形式的蛋白没有拓扑异构酶活性，并且细胞内过量的铁还可以竞争锌对大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的结合，从而抑制其活性。而氧化和还原条件对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性具有可逆性的调节作用。此外进一步发现铁的结合位点存在于大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ的第一个和第二个锌指结构上，与第三个锌指结构无关。并且与第三个锌指结构相比，第一个和第二个锌指结构对拓扑异构酶活性的维持作用是非常重要的。另外发现铁结合形式的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ锌指结构域对DNA的结合能力比锌结合形式的有所降低，而铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ后可引起蛋白空间构象的改变，表现为内源性荧光强度的减弱。进一步实验发现大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是否具有完整的拓扑异构酶活性与结合的金属种类无关，而可能与结合的金属数目有关。以上实验结果证明，铁结合大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ后使其活性受到抑制的分子机制在于铁离子通过和第一个和第二个锌指结构的不恰当结合使其空间构象发生改变，和DNA结合的能力下降，最终影响其拓扑异构酶活性。