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目的:糖尿病肾病已成为全世界终末期肾病的主要原因,目前尚无有效治疗药物。研究表明糖尿病环境下SIRT1表达下降是糖尿病及其并发症发生发展的原因之一。已有大量研究显示应激情况下SIRT1可通过促进新生血管形成、抑制氧化应激、抗凋亡信号通路、重塑能量代谢通路而促进细胞存活。同时,有研究发现糖尿病时肾小管而非肾小球的SIRT1表达水平下降与糖尿病肾病有关,SIRT1表达下降可直接或间接激活相关信号通路导致细胞的损伤和凋亡,造成糖尿病并发症的发生,但目前为止导致SIRT1功能受损的上游信号途径并未阐明。microRNA是一种17-25个核苷酸的非编码RNA分子,它们通过降解信使RNA或抑制其翻译,从而负向调控靶基因的表达。已有研究显示,microRNAs参与了多种肾脏疾病的发生发展,例如糖尿病肾脏病变(diabetic kidney disease,DKD)、急性肾损伤、狼疮性肾炎、多囊肾病等。而且有研究发现,在糖尿病时肾脏microRNAs的表达谱出现明显变化。因此我们推测糖尿病时肾脏局部的microRNAs的表达异常可能是肾脏SIRT1功能受损的原因,为此我们开展了一系列研究。方法:1.动物实验分析SIRT1激动剂对糖尿病大鼠肾损伤的改善作用:以自发性2型糖尿病大鼠(ZDF大鼠)为研究对象,予高脂饲料喂养。分为对照组、糖尿病组、SIRT1激动剂——白藜芦醇干预组。记录其血糖、体重、糖耐量实验情况,生化学检测三组肾小管功能指标、肝肾功能,HE、透射电镜观察肾脏病理情况,免疫组化检测SIRT1及其下游蛋白表达情况。研究SIRT1激动剂是否可改善糖尿病大鼠肾脏的结构及功能。2.临床研究筛查糖尿病肾病早期患者尿液中参与调控SIRT1的microRNAs:通过基因芯片技术分析糖尿病早期肾损伤患者及糖尿病对照患者尿液microRNAs表达谱,筛查差异表达microRNAs,并进行靶蛋白通路探索。生化法检测患者肝功能、肾功能、血脂、血糖;留取晨尿,生化法检测肾小球及肾小管损伤指标。采用双荧光素酶报告实验验证差异表达microRNAs对SIRT1的直接调控作用。3.细胞实验验证以上差异表达microRNAs对SIRT1及下游信号通路的调控机制:以人肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象,分别在正常葡萄糖浓度(5.5 mmol/L)和高糖(25.5 mmol/L)中进行培养。分析差异表达microRNAs对SIRT1及其下游信号通路的影响,并应用激光共聚焦显微镜观察细胞内吞荧光标记的白蛋白的变化。结果:1.动物实验结果:1)糖尿病组、白藜芦醇组空腹血糖随时间呈逐渐上升趋势,而对照组血糖平稳;三组空腹血糖在基线无差异,12周龄时糖尿病组、白藜芦醇组均明显高于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠体重随时间稳定增长,糖尿病组及白藜芦醇组体重大于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05)。2)随病情进展,可见白藜芦醇组及糖尿病组糖负荷后各时间点血糖逐渐增加(P<0.05),AUC增大。药物干预前,各组大鼠糖耐量无显著差异(P>0.05)。12周龄时与对照组相比,白藜芦醇组与糖尿病组各时间点高于对照组(P<0.05)。3)三组间TF、IgG、β2-MG未见明显差异。糖尿病组较对照组RBP、UMA、NAG、NGAL表达增高有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇组相对于糖尿病组UMA、NAG、NGAL表达下降差异具有统计学意义(P<0.05)。4)各组大鼠肝功能、肾功能未见明显变化,白藜芦醇干预后未见与其他两组有显著差异(P﹥0.05)。5)HE染色结果显示:糖尿病组肾小球系膜区稍增宽,系膜细胞及系膜基质未见增多,小动脉管壁增厚,毛细血管扩张;肾小管上皮细胞轻度肿胀、管腔变小。白藜芦醇干预组:肾小球、肾小管结构较糖尿病组改善。系膜区域未见基质明显增多,肾小球未见硬化,肾间质未见明显纤维增生炎症浸润。6)电镜结果显示:超微结构显示糖尿病组近曲小管、肾小管周小血管内皮细胞肿胀、系膜细胞存在线粒体轻度肿胀,部分嵴和膜融合模糊不清,粗面内质网轻度扩张有颗粒融合和脱颗粒现象。白藜芦醇组上述变化明显改善。7)免疫组化显示糖尿病鼠的肾组织SIRT1表达下降,代表自噬功能的Beclin表达下降、p62表达升高;代表肾小管功能的Cubilin表达下降。而白藜芦醇可改善这一现象。2.人群研究结果:1)DM组相对于NC组TF、IgG、NAG升高且有统计学差异(P<0.05)。DKD组相对于DM组NC组UMA、TF、IgG、RBP、β2-MG表达升高有统计学差异(P<0.05)。2)相对于DM组DKD组上调的miRNA有:hsa-miR-6785-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-7641、hsa-miR-7977、hsa-miR-7975、hsa-miR-601、hsa-miR-7150、hsa-miR-193b-5p。相对于NC组DM组升高的miRNA有:microRNAs包括hsa-miR-4484、hsa-miR-6860、hsa-miR-5692a、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-4470、hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-7641、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-6515-5p、hsa-miR-6824-5p、hsa-miR-6125、hsa-miR-7846-3p、hsa-miR-6792-5p、hsa-miR-1914-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-6134、hsa-miR-1295a、hsa-miR-4259、hsa-miR-7977、hsa-miR-7975。3)调控SIRT1的有hsa-miR-601,hsa-miR-7641,hsa-miR-7150,其中hsa-miR-7641表达上调。3细胞实验:双荧光素酶结果显示mir-7641可以直接调控SIRT1。高糖干预肾小管上皮细胞后,mir-7641表达明显升高(P<0.05),SIRT1蛋白和mRNA水平降低(P<0.05)。与对照组相比mir-7641 inhibitor组SIRT1的表达升高,p-AMPK/AMPK,Beclin-1均升高(P<0.05),p62表达降低、白蛋白内吞能力升高(P<0.05)。与对照组相比,mir-7641 mimics组SIRT1表达进一步降低,p-AMPK/AMPK,Beclin-1均降低(P<0.05),p62表达升高(P<0.05)。结论:1.糖尿病时肾小管已经存在SIRT1表达下降,同时肾小管出现结构及功能改变;而应用SIRT1激动剂可以改善DM鼠的肾小管结构及功能。同时,我们发现SIRT1激动剂可以改善肾小管的细胞自噬功能。因此推测SIRT1可能通过改善肾小管的自噬而改善肾小管的结构及功能。2.糖尿病期患者在出现微量白蛋白以前已出现不同程度肾损害,尿液转铁蛋白、免疫球蛋白、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶有升高。与此同时,糖尿病患者尿液中出现多种microRNA的改变。其中mir-7641明显升高,可能是早期诊断糖尿病期肾损伤的分子标志物。3.糖尿病时mir-7641可能靶向负调控SIRT1/AMPK/自噬信号通路,引起肾小管上皮细胞功能受损进而导致白蛋白重吸收作用减弱。