背景及目的： 肠道菌群是构筑肠道粘膜屏障的主要组成部分，在维持肠道功能及机体的健康方面发挥着重要的生理意义。胃肠功能的紊乱，包括菌群失调、便秘、及胃粘膜的损伤是临床常见的药物并发症，也是现代生活模式下发病率高、患病人群范围较广的一类疾病。乳酸杆菌和双歧杆菌是肠道有益菌的主体，是肠道生物屏障的重要组成部分，与胃肠道的免疫、营养及正常功能的维持紧密相关。 微生态学运用“以菌治菌”的理论，通过生物拮抗纠正微生态失衡，是治疗医学和预防医学的重要补充，是一种全新的治疗观念，不仅可以避免上述抗生素应用的副作用，而且在临床实践上的初步研究中已收到了十分肯定的疗效，具有极大的发展潜力，可以成为防治肠源性感染的新措施。而目前国内已有的微生态制剂多存在配方单一及功效不稳定等问题，限制了微生态制剂的应用和发展。因此，本研究拟筛选一株性能良好的乳酸杆菌，与益生元合理配伍，组成合生元配方，通过动物试验验证其对胃肠道的调节作用，包括对肠道菌群的调节作用，润肠通便作用及对胃粘膜损伤的辅助保护作用；并采用先进的冷冻干燥工艺将其制成一种性能稳定的新型微生态制剂，使其充分发挥对胃肠道的调节作用。 方法与结果： 1．益生菌菌株的筛选 (1)采用人工胃液、人工肠液模拟上消化道环境，检测两株候选菌株L. acidophilus, L. rhamnosus对上消化道环境的耐受性。结果：两株候选菌株均可耐受pH＞3.0的人工胃液，L.acidophilus可耐受人工肠液中0.3％的胆盐浓度，L.rhamnosus可耐受0.2％的胆盐浓度。 (2)通过体外培养人结肠癌细胞株HT-29，与候选菌株共孵育，采用普通光镜和扫描电镜观察候选菌株对HT-29的粘附情况，检测L.acidophilus, L.rhamnosus在肠道的定植能力。结果：普通光镜观察可见L.acidophilus, L.rhamnosus粘附于HT-29细胞边缘，平均4.5～7个／细胞，L.rhamnosus的粘附量略低；扫描电镜观察可见L.acidophilus粘附于HT-29细胞表面，且细胞器结构完整，无损伤。第三军医大学硕士学位论文 (3)收集候选菌株36h培养乏液(S CS)，以琼脂扩散打孔法，检测候选菌株SCs对4种常见肠道致病菌的抑菌能力。结果:L.aci‘IOPhilus对4种肠道致病菌的抑菌圈直径均在13~以上，L.rkamnosus对4种肠道致病菌的抑菌圈直径均在12~以上。 (4)通过体外益生元促有益菌增殖实验，确定益生元的种类和浓度;通过小鼠体内试验，对9种复合配方进行筛选，确定最佳合生元配方。结果:5%的低聚异麦芽糖和L.aci峨，hilus组合体内外效果最好，确定为最佳配方。 2.合生元配方对胃肠道功能的调节作用 (l)通过抗生素脱污染建立肠道菌群失调大鼠模型，给予合生元灌胃，检测合生元对模型大鼠肠道菌群调节情况。结果:喂服合生元后，肠道菌群向良性发展，slgA水平升高，光镜下可见肠粘膜较完整，绒毛排列整齐，图像分析可见绒毛高度和隐窝深度均有所增加。 (2)以复方地芬诺酷建立小鼠便秘模型，检测合生元对小鼠润肠通便的效果。结果:复方地芬诺酷造成的小鼠便秘模型，灌喂合生元配方后，小肠推进率比模型对照组提高26.90’o，首粒排便时间缩短sZmin，6h内排便总量增加129。 (3)sD大鼠灌喂合生元30d后，以无水乙醇和消炎痛分别复制胃粘膜损伤模型，检测合生元对胃粘膜损伤的辅助保护功能。结果:喂服合生元后，大鼠胃粘膜损伤指数明显降低，光镜下观察胃粘膜较完整，充血和溃疡程度减轻。 3.建立菌株冷冻干燥工艺 (l)参考常用菌株冷冻干燥保护剂配方及浓度与L.aci峨，hilus混合后进行冻干，以冻干品外观、活菌数及含水量作为质控指标，进行反复筛选，最后选择脱脂奶粉为最优保护剂配方。 (2)通过正交实验对菌株冷冻干燥工艺参数进行多次反复实验验证，建立了完整的冷冻干燥工艺参数，使产品保持较高的活菌数并提高了产品的稳定性。 (3)菌龄的选择:在冻干曲线的指导下，对不同菌龄的细菌进行平行冻千试验，以确定菌液最佳收获时期，结果证明对数生长末期或稳定初期的细菌，冷冻干燥后菌株活力较好。 结论 本研究通过一系列体外实验筛选出一株对上消化道有较好的耐受性，并能在体内稳定定植且具有较强的抑菌特性乳酸杆菌L.aci峨，hilus:同时筛选出对有益菌促增殖效果较好的益生元种类和浓度，与益生菌配伍组成合生元，通过体内实验确定最佳合生元配方。经动物实验验证，该合生元配方对肠道菌群有一定的调节作用，并具有较第三军医大学硕士学位论文好的润肠通便作用且对胃粘膜损伤有一定的保护作用。通过30d稳定实验，证明所建立的菌株冷冻干燥保藏工艺能较好的保持L.acidOI，hilus的活性，具有一定的可行性。