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CRISPR/Cas系统作为众多细菌与古生菌的获得性免疫系统，可以在CRISPR基因介导下，Cas基因表达的蛋白沉默与切割外来的遗传物质。在Ⅱ型CRISPR/Cas系统中，Cas9蛋白质可以单独完成crRNA的加工与外来基因沉默，被改造为新一代基因编辑工具CRISPR/Cas9系统。在所有的CRISPR/Cas9系统中，最常用的是从酿脓链球菌中提取的SpCas9。SpCas9因拥有极简的PAM序列:5-NGG-3，可以针对几乎所有基因序列进行编辑，十分简单便捷，并且被改造成全基因组筛选(Genome-Scale Screening)的工具。但是，SpCas9仍有两点局限性:第一，CRISPR/SpCas9系统在干细胞与胚胎细胞上的基因编辑效果差;第二，传统的核酸酶运输方式（脂质体转染或病毒感染方式）以及sgRNA的高容错性易导致SpCas9系统会产生脱靶效应。针对这两点局限，我们希望通过改造SpCas9蛋白质以获得更高的基因编辑效率，并且采用核酸酶蛋白(Ribonucleoproteins，RNP)直接处理细胞或胚胎的方式来有效减少脱靶效应。 首先，我们通过在N端和C端融合不同数目的NLS，系统性地设计了不同NLS组合的NLS-SpCas9蛋白质，通过评价敲除CCR5基因的效率与修正移码EGFP基因释放荧光信号强弱两个筛选系统来挑选最佳的NLS-SpCas9改造蛋白;研究发现经过改造的NLS-SpCas9，如:N1/C2和N0/C4;表现出比WT SpCas9高出5倍的基因编辑效率;筛选完成后，我们对筛选得到的NLS-SpCas9蛋白质进行了多方位的评估，包括计量依赖实验，时间依赖实验，脱靶效应的检测，多基因位点的检测等，这些指标均表明通过增加两端NLS数量，可以有效地提高基因编辑效率。在检测细胞核内的SpCas9蛋白质的降解时间与NLS关系的实验中，我们猜测NLS的增加有助于帮助SpCas9蛋白在相同时间内更多地进入细胞核以发挥基因编辑效果。最后，我们通过小鼠胚胎进一步比较了WT SpCas9和N0/C4SpCas9的基因编辑效果，从胚胎层面进一步肯定了N0/C4有效地提高了基因编辑效率。