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蚜虫是世界性农业害虫,可根据光周期的变化而进行孤雌生殖或有性生殖,但相关分子机制尚不清楚。以往研究多以豌豆蚜为材料,但其为同寄主全周期蚜虫,性雌和雄蚜均由性母(sexupara)产生。而关于棉蚜生殖型转变的研究较少,作为异寄主全周期蚜虫的代表,虽不知其雄蚜如何产生,但可确定其有专产性雌的生殖型,即雌性母(gynopara)。雌性母行孤雌生殖,后代却进行有性生殖,是棉蚜由无性生殖转入有性生殖的过渡虫态,具有重要研究价值。因此,本文针对棉蚜生殖可塑性分子调控机制这一科学问题,以雌性母为主要研究对象,从其分化关键期筛选开始,经过系统研究,构建了棉蚜生殖型可塑性研究平台,并初步揭示营养信号在棉蚜生殖方式转变中发挥关键作用,所取得的主要成果如下: 1.构建了棉蚜雌性母诱导平台并明确了雌性母形成临界期。1龄孤雌蚜在低温短光照(8L∶16D,18℃)条件下,其成虫期有两个生殖高峰,先产雌性母而后产雄蚜,二者比例接近2∶1。将其命之为雌性母之母(gynopara-producer,GPP),其卵巢管中首胚、次胚发育为雌性母,三胚发育为雄蚜。雌性母与雄蚜的翅原基在幼虫期不断发育,成虫期翅芽羽化。雌性母发育进程中,体色逐渐加深、体壁逐渐硬化,但卵巢却退化,卵巢管中仅有首胚可发育成熟。光温逆转试验证明胚胎期、1龄、2龄是雌性母形成的关键期,其中1龄是临界期。2龄之后,高温长光照亦不能改变雌性母的发育方向,但其产下的性雌却可发育为中间型性雌,卵巢中同时具有卵与胚胎。中间型性雌始现于将1龄雌性母转移到长光照,因此,1龄也是棉蚜由无性生殖转向有性生殖的临界期。 2.构建了棉蚜转录本数据库和RNA干扰平台。通过对棉蚜不同生殖型进行denovo测序,共得到50006条转录本,平均长度为628nt,其中39597条转录本得到注释,且可富集到257个信号通路中。棉蚜个体小、体壁薄、体液多,RNA干扰难度较大。为此,本研究建立了注射和饲喂两种棉蚜RNA干扰方法。注射法选择在棉蚜背部中胸和后胸节间膜处注射,成活率可达90%,以10ng剂量(2.2μg/μL×4.6nL)进行干扰效果较佳,注射后3d干扰效率可达50%,基因沉默效应可维持5天。饲喂法以含dsRNA(终浓度为100ng/μL)的人工饲料饲喂棉蚜,3天后可检测到最大干扰效率50%,但仅可维持3天。此外,采用带荧光标记的Cy3-siRNA检测了注射法和饲喂法siRNA在棉蚜体内的去向、分布与滞留时间,发现采用注射或饲喂siRNA均可进入棉蚜的表皮、中肠以及卵巢等组织,且至少可维持24h不被降解。 3.分析了雌性母形成关键期差异表达基因,干扰Tret1、InR1后雌性母形成受阻。从胚胎期到1龄期,上调差异基因有1158个,下调差异基因有2632个;从1龄期到2龄期,上调差异基因有115个,下调差异基因有243个。差异基因富集到神经肽激素、表皮构成、跨膜运输、碳水化合物代谢等信号通路。碳水化合物代谢、淀粉与蔗糖代谢等营养相关信号通路上调,且在之前的研究中(雌性母vs.孤雌)同样被富集到,暗示性母形成与营养相关。因此,选取两个营养相关基因InR1、Tret1分别进行干扰,结果发现抑制了雌性母的形成,使其翅退化或消失,成为畸形蚜或无翅蚜。 本研究明确了棉蚜雌性母、雄蚜、性雌的产生方式,确定了雌性母的形成节点为1龄,构建了棉蚜性蚜诱导方法和基因干扰平台。这些结果与方法为进一步的研究奠定了基础,且对其他蚜虫生殖型调控的研究有重要借鉴意义。