PGE2高灵敏度ELISA检测方法的建立

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目的:利用纯化的前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)单克隆抗体(mAb-1G)建立检测PGE2的高灵敏度ELISA测定方法,利用此方法测定了经典炎症细胞模型LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌PGE2的情况。方法:采用硫酸铵沉淀法纯化得到了产量较高的且符合实验要求的单克隆抗体mAb-1G。并合成了PGE2-多聚赖氨酸(PLL)以及PGE2-碱性磷酸酶(AKP)两种偶联物,选择TNBS法检测了偶联比率。然后利用纯化的抗体与偶联物共建立四种ELISA检测方法:间接竞争ELISA法,直接竞争ELISA法,改良型直接竞争ELISA法(比色法)以及改良型直接竞争ELISA法(荧光法)测定PGE2;建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应模型,采用改良型直接竞争ELISA法(荧光法)测定经典炎症细胞模型LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌PGE2的情况。结果:间接竞争ELISA法,直接竞争ELISA法,改良型直接竞争ELISA法(比色法)和改良型直接竞争ELISA法(荧光法)的检测范围分别为1.56~50.00μg/mL;0.63~20.00μg/mL;1.95~250.00ng/mL;0.156~5.00ng/mL。在细胞模型中,采用改良型直接竞争ELISA法(荧光法)测定细胞上清,结果显示,LPS (10ng/mL)刺激24h后可显著增高RAW264.7巨噬细胞PGE2的分泌,而在该模型下,中药六类新药原生痛对PGE2的增加无明显的抑制作用。结论:建立了测定PGE2高灵敏度的改良型直接竞争ELISA法(荧光法),最低检测限可以达到pg/mL级别,可用于测定细胞培养上清中的PGE2。原生痛对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌PGE2无抑制作用。本研究所建立的改良型直接竞争ELISA法(荧光法)可用于pg/mL级别PGE2准确、快速及灵敏度测定。
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