两栖动物是脊椎动物从水生到陆地的过渡类群,具有复杂的生活史,既能适应水生环境又能适应陆生环境。繁殖和免疫对两栖动物适应水生和陆生环境具有非常重要的意义。精卵结合是两栖动物成功受精的必要步骤,精子与卵子上表面蛋白的相互作用是保证精卵特异结合的关键因素,且精卵识别具有高度的物种特异性。然而,关于两栖动物精卵结合蛋白的研究比较少。同时,两栖动物在经历复杂的生活史和栖息于多样的生境中时,更易遭受外界病菌和寄生虫的侵袭,但是关于两栖动物免疫基因的系统研究还比较有限。关于以上问题的系统研究将有助于我们从分子层面了解两栖动物的繁衍、抗病和适应环境的能力,从而对两栖动物的进化和保护提供理论基础。基于以上问题,我们利用二代高通量测序技术,对两栖动物5科12个物种的精巢、卵巢以及皮肤组织进行了转录组测序,通过注释结果筛选两栖动物精卵结合和免疫相关基因的基因家族,并结合Genbank上已有两栖动物的基因数据,综合分析了两栖动物精卵结合以及免疫相关基因的表达与进化,获得了以下研究结果:1.通过对两栖动物5科12个物种的精巢、卵巢和皮肤组织进行转录组测序,我们得到了范围为23 940 046-35 427 271条的raw reads片段,过滤后得到范围为19 792 130-34 524 624条clean reads片段。通过Trinity组装并分别用脚本去除重复和冗余,获得每个样品的unigene,unigenes 的 N50 范围为 893-2663 bp。将 reads 回比到 unigenes 的映射率（mapping rate）范围为72.99%-88.3%,通过BLAST将unigenes与各大数据库比对进行基因功能注释,Nr库注释率在不同两栖动物中的范围为34.55%-49.04%,表明我们的组装和注释质量较高。运用Gene Ontology（GO）注释进一步对unigenes进行功能分类,以了解unigene主要参与的生物功能。GO注释信息表明不同两栖动物的unigene中与繁殖和免疫相关的GO terms具有相似的分布比例。2.通过挑选uingenes中与精卵结合和免疫相关的基因,来分析12个两栖动物精卵结合和免疫相关基因的表达。对于两栖动物精卵结合基因的表达研究,我们发现两栖动物卵子上表达的精卵结合蛋白主要为透明带蛋白（Zonapellucida,ZP）。我们以ZP3基因为例做RACE扩增实验来验证转录组组装序列,结果显示转录组所筛选的ZP3序列与实验扩增序列高度吻合,说明我们的转录组组装序列准确性较高可进行后续分析。通过分析,我们发现两栖动物ZP家族基因并非是卵巢特异表达基因,在精巢和皮肤组织中也同样表达,但是皮肤组织中表达量较低。ZP基因家族在两栖动物生殖腺中表达的组分为:ZP1,ZP2,ZP3,ZP4和ZPAX,其中ZP1基因在无尾目中的表达为首次发现。不同两栖动物在卵巢中所表达的ZP组分一致,说明两栖类ZP基因的表达在种间差异不大。相对于ZP蛋白,两栖动物与卵结合蛋白的表达与哺乳类相差较大。在哺乳动物精子上表达的重要精巢蛋白,在两栖动物中大多不表达,仅发现了 β-1,4-半乳糖转移酶（β-1,4-galactosyltransferase4,BGalT4）、Zonadhesin（ZAN）、A disintegrin and Metalloprotease 28（ADAM28）、Sperm surface protein17（SP17）以及 Sperm associated antigen（SPAG）家族基因在两栖动物中的表达。其中,ADAM28在两栖动物中并非生殖腺特异性表达,在皮肤组织中也同样表达。SP17和ZAN基因也并非精巢特异表达基因,在卵巢组织中也有表达,但是在皮肤组织中不表达。另外这些精子蛋白基因在不同物种之间的表达是有差异的,有的基因只在少数几个物种中表达。对于两栖动物免疫基因的表达研究,我们从unigene中挑选出了大量的免疫基因,其中固有免疫基因的数目要远远大于适应性免疫基因。我们总共挑选出19种抗菌肽家族和195个其它的固有免疫相关基因（包含Cluster of differentiation分子）。通过分析隶属于3科的两栖动物皮肤组织所表达的抗菌肽种类,发现3个科两栖动物所表达的抗菌肽种类存在差异,但差异不显著。其它固有免疫基因在皮肤、精巢和卵巢三个组织中都有表达,但不同基因家族在不同物种之间表达的组分存在差异。适应性免疫基因主要为Major histocompatibility complex（MHC）基因和部分 Cluster of differentiation（CD）分子。两栖动物MHCI类基因主要表达的为经典I类基因（MHCIa）和非经典I类基因（MHCIb）;MHCⅡ类基因主要表达DRA,DQA,DMB,DRB以及不分位点的α链。MHC基因在三个组织中都有表达,但不同两栖动物所表达的基因位点存在差异。3.基于12个两栖动物的转录组数据以及Genbank上两栖动物相关基因数据,我们分析了两栖类精卵结合和免疫相关基因的进化。对两栖动物精卵结合基因的进化分析表明,ZP2,ZP3,ZP4和ADAM28基因均具有基因同源域的表达,其中ZP3基因至少有6种同源域基因,说明两栖类ZP2,ZP3,ZP4和ADAM28基因受到基因复制的影响。通过构建进化树,我们发现两栖动物ZP3基因在ZP家族中最先进化,且ZP1和ZP4高度同源,具有共同的祖先。通过正选择检测发现,所有ZP家族中只有ZP1基因检测到两个正选择位点,暗示ZP1基因可能对两栖类精卵结合具有重要作用。对实验所扩增的ZP3序列进行进化分析显示,不同物种和相同物种（不同地域）的两栖动物ZP3基因在3’端,5’端和全长也不受正选择。精子上的相关基因中,只有SPAG 9基因检测到1个正选择位点。总的来说,精卵结合相关基因在进化过程中,基因复制作用强于正选择作用。对两栖动物免疫基因的进化分析表明,两栖动物的少数固有免疫基因具有基因拷贝,其余大部分都是独立基因。正选择分析发现,抗菌肽和大部分固有免疫基因都不受正选择。这说明固有免疫基因中只有少数几个基因受基因复制和正选择单独或共同作用,大部分固有免疫基因都比较保守。在两栖动物MHC基因中,无论是MHCI类基因还是Ⅱ类基因都至少有两个不同的基因拷贝,且都存在跨物种多态性。通过对MHCI类基因外显子2,3,4序列和MHC Ⅱ类基因外显子2序列进行正选择分析发现,MHC I类基因具有8个正选择位点,MHC Ⅱ类基因β链受到显著的正选择,而α链只有DRA具有一个正选择位点。MHC Ⅱ类基因DMB受到正选择作用在两栖动物中为首次发现,且DMB具有9个正选择位点。DRB也发现了 8个正选择位点。部分CD基因也在不同两栖物种中发现了不同的基因拷贝。进化树显示CD9与CD81关系密切,而与其他CD分子关系较远,并且CD9,CD81和CD3g中也检测到了正选择信号,而这些CD分子均在适应性免疫中起关键作用,说明了适应性免疫相关基因的进化速率要快于固有免疫基因。综上所述,通过转录组测序,我们总共得到了包括12个两栖动物的精巢、卵巢和皮肤组织的高质量转录组序列。通过对两栖动物精卵结合以及免疫基因的表达分析,我们发现精卵结合基因并非生殖腺特异性表达,有些在皮肤组织中也表达。不同两栖动物之间ZP组分的表达一致,但与卵结合的基因的表达存在物种差异。同时,免疫基因的表达也存在物种差异。进化分析表明,两栖动物精卵结合基因受到基因复制的作用强于正选择作用。两栖类的免疫基因中,固有免疫基因相对比较保守,而适应性免疫基因进化速度相对比较快。我们的研究将有助于从分子层面理解两栖动物的繁殖、抗病能力以及适应性进化,也有助于对两栖动物的保护提供理论基础。