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目的及意义:构建针对乙肝病毒(HBV)前c/c区的短发夹环RNA(shRNA)的慢病毒表达载体质粒(pls),通过pls感染含乙肝病毒的肝癌细胞,观察siRNA对e抗原表达的抑制作用,探讨siRNA对HBV增值的抑制作用,为应用RAN干扰技术治疗HBV感染奠定实验基础。方法:1、采用DNA重组技术等基因工程技术,针对HBV prec/c基因序列设计两对寡核苷酸靶向序列和一对无关序列,并由上海生工化学合成。2、将合成的寡核苷酸与通过限制性内切酶消化的含U6启动子及表达GFP基因的慢病毒表达载体Plentilox3.7连接,转化大肠杆菌DH5α,酶切、测序进行鉴定。3、将重组体与辅助质粒系统共转染293T细胞包装病毒颗粒。4、收集病毒液,感染Hep-G2 2.15细胞,用RT-PCR检测HBVprec/c mRNA转录, MEIA检测细胞裂解液和培养上清中HBeAg的表达水平。结果:1、经酶切、连接、转化、鉴定和基因序列测定证实已成功构建含shRNA的慢病毒表达载体。2、与辅助质粒系统共转染293T细胞,成功组装慢病毒颗粒。3、将病毒液感染Hep-G2 2.15细胞,通过MEIA检测细胞裂解液和培养上清中HBeAg的表达,均有不同程度的抑制。同时提取总RNA,通过RT-PCR证实,两对寡核苷酸靶向序列对HBVprec/c的转录同样存在抑制作用。结论:1、检测结果证实HepG-2.2.15细胞表达HBV抗原、分泌产生HBeAg,并转录HBeAg mRNA,因此可作为使用RNA干扰技术抑制HBV抗原表达作用研究的靶细胞。2、成功构建带U6启动子及表达GFP基因的shRNA慢病毒表达载体Pls,为应用该载体进行体内外RNAi相关研究提供了实验材料。3、观察结果证实通过构建含shRNA慢病毒表达载体与包装质粒成功组装病毒颗粒,通过感染Hep-G2 2.15细胞,能抑制HBeAg的表达,因此可作为RNA干扰研究的靶载体。4、验证在Hep-G2 2.15细胞均可显著抑制HBeAg表达的两对寡核苷酸序列,为将RNA干扰技术用于乙肝治疗的深入研究提供了实验依据。