第一部分缺氧诱导因子-1α RNA干扰慢病毒的制备和干扰靶点评价目的：将设计的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的RNA干扰靶点连接到慢病毒载体,并确定其能否有效转染McA RH7777细胞,评价敲低HIF-1α的程度,选择最佳靶点用于后续研究。方法：设计4个HIF-1α的RNA干扰靶点和1个阴性对照(NC)靶点,将RNA干扰靶点分别连接到pGCSIL-GFP慢病毒载体；将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中,选择阳性菌落进行PCR扩增和基因测序鉴定RNA干扰靶点是否成功连接到慢病毒载体；进一步将连接有RNA干扰靶点的慢病毒载体进行扩增并进行滴度测定；应用慢病毒载体转染McA RH7777细胞,将转染后的McA RH7777细胞进行细胞爬片和DAPI染色确定转染效率,并进行荧光定量反转录聚合酶链反应试验,确定转染后HIF-1α敲低的程度。结果：将RNA干扰靶点均连接到慢病毒载体并转化到感受态细胞,对阳性菌落进行PCR扩增,各靶点病毒载体的扩增长度分别为：NC,343bp；Targetl,347bp； Target2,347bp；Target3,347bp; Target4,346bp.经基因测序中证明RNA干扰靶点均连接到慢病毒载体。成功对慢病毒载体进行扩增和滴度测定,各载体的滴度分别为：HIF-1α-LV-NC,5E+9TU/ml,HIF-1α-LV-Targetl,4E+8TU/ml； HIF-1α-LV-Target2,5E+8TU/ml；HIF-1α-Lv-Target3,7E+8TU/ml；HIF-1α-LV-Target4,7E+8TU/ml.经细胞爬片和DAPI染色确定慢病毒转染McA RH7777细胞的效率均在95%以上；在各病毒转染McA RH7777后,经反转录聚合酶链反应试验确定HIF-1α的相对表达量分别为：Wild type,1.01±0.09；NC,1.02±0.08；Targetl,0.50士0.13；Target2,0.23±0.13；Target3,0.71±O.10；Target4,0.82±0.11。选择靶点Target2作为后续的实验研究的靶点。结论：HIF-1α的RNA干扰靶点能够成功连接到慢病毒载体pGCSIL-GFP；慢病毒载体pGCSIL-GFP能够转染McA RH7777细胞,并有着较高的转染效率；在McA RH7777细胞中,可以通过RNA干扰的方法敲低HIF-1α的表达。第二部分缺氧诱导因子-1α的RNA干扰减低缺氧肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力目的：本研究探索慢病毒调节的HIF-1α的RNA干扰在缺氧的条件下能否敲低HIF-1α的表达和进一步抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达,能否抑制HCC细胞的增殖,侵袭和迁移能力。方法：应用慢病毒构建HIF-1α的RNA干扰载体感染大鼠肝癌细胞系McARH7777,在正常氧条件和缺氧的条件下进行不同时间段的培养。应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹分别检测HIF-1α和VEGF的RNA和蛋白表达水平。通过细胞活性实验,Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的增殖,迁移和侵袭能力。结果：反转录聚合酶链反应分析结果：在常氧条件下,HIF-1αRNA干扰分别使McA RH7777细胞中HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平减低76.94%和53.72%。在缺氧条件下,在HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平最高时,对照组细胞HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平分别是RNA干扰组细胞的3.83倍和2.90倍。HIF-1α和VEGF的mRNA表达在RNA干扰组和对照组的相关系数分别是0.84和0.83,HIF-1α和VEGF无论是在RNA干扰组还是在对照组都显著相关(p<0.05)。HIF-1αRNA干扰显著抑制缺氧诱导的HIF-1α和VEGF mRNA的升高。免疫印迹分析结果：在HIF-1α RNA干扰的细胞内HIF-1α的蛋白量在常氧条件和缺氧6小时的条件下分别是对照组细胞的0.10倍和0.18倍。在HIF-1αRNA干扰的细胞内VEGF的蛋白表达量在常氧条件和缺氧6小时的条件下分别是对照组细胞的0.71倍和0.47倍。HIF-1α RNA干扰显著抑制缺氧诱导的HIF-1α和VEGF蛋白的升高。迁移实验结果：在常氧条件下,HIF-1α RNA干扰组穿过小室的细胞数目(35.17±8.64)显著低于对照组穿过小室的细胞数目(46.83±9.50)(p<0.05)；在缺氧条件下,HIF-1α RNA干扰组穿过小室的细胞数目(48.17±10.76)显著低于对照组穿过小室的细胞数目(75.83±8.13)(p<0.05)。HIF-1α RNA干扰显著抑制缺氧诱导的细胞迁移能力的升高。侵袭实验结果：在常氧条件下,HIF-1α RNA干扰组穿过小室的细胞数目(25.33±6.92)显著低于对照组穿过小室的细胞数目(36.83±7.47)(p<0.05)；在缺氧条件下,HIF-1α RNA干扰组穿过小室的细胞数目(32.67±7.94)显著低于对照组穿过小室的细胞数目(47.33±6.95)(p<0.05)。HIF-1α RNA干扰显著抑制缺氧诱导的细胞侵袭能力的升高。细胞活性实验结果：缺氧显著减低HIF-1αRNA干扰细胞的活性。在不同的缺氧条件下所有的药物相互作用系数均小于1,显示出HIF-1α的RNA干扰协同缺氧抑制McA RH7777肿瘤细胞的生长。结论：利用慢病毒转染敲低的HIF-1α引起McA RH7777细胞在缺氧或正常氧条件下VEGF在RNA水平和蛋白水平的降低。同时导致在缺氧条件下增强的细胞迁移和侵袭能力的降低。HIF-1α的RNA干扰以协同的方式与缺氧抑制细胞的增殖。第三部分缺氧诱导因子-1α的RNA干扰在大鼠模型上改善经动脉栓塞治疗肝癌的研究目的：本研究在动物模型上探讨能否通过HIF-1α的RNA干扰改善经动脉栓塞(TAE)治疗肝癌的疗效。方法：分别将HIF-1α的RNA干扰病毒载体和阴性对照病毒载体转染大鼠肝癌细胞系McA RH7777细胞,并分别种植皮下瘤。应用皮下瘤建立两组移植瘤的大鼠肝癌模型,每组16只,分别对每组的8只应用超液态碘化油进行栓塞,另外8只做对比仅给予生理盐水灌注,即分成4个治疗组,分别为：siHIF-1α+TAE组,siHIF-1α组,TAE组,和对照组。大鼠的TAE治疗是通过在大鼠的胃十二指肠动脉逆向插入微导管的方法进行的。经TAE治疗4周后处死大鼠,收集肝肿瘤标本和肺标本,研究各组大鼠肿瘤的大小差异,通过HE染色对比各组大鼠肺转移情况的差异,应用免疫组织化学分析对比各治疗组HIF-1α,VEGF和MVD的表达差异,进一步应用免疫印迹分析对比各组HIF-1α和VEGF的蛋白表达的差异。结果：免疫组织化学分析结果：HIF-1α、VEGF和CD31在siHIF-la组肿瘤内的表达显著低于其在对照组的肿瘤内的表达(42.69±12.13vs59.24±15.35；51.21±12.23vs68.75±13.81；39.70±15.25vs58.90±15.12)(p<0.05)；HIF-1a、VEGF和CD31在siHIF-1α+TAE组肿瘤内的表达显著低于其在TAE组的肿瘤内的表达(48.32±13.76vs74.26±14.78；57.39±13.41vs83.46±14.35；45.20±16.44vs69.15±16.88)(p<0.05)。HIF-1α的RNA干扰在组织水平上敲低TAE诱导的HIF-1α、VEGF和CD31的升高。免疫印迹分析结果：HIF-1α和VEGF在siHIF-1α组肿瘤内的蛋白表达显著低于其在对照组的肿瘤内的蛋白表达(0.26±0.06vs0.40±0.06；0.61±0.07vs0.78±0.07)(p<0.05)；HIF-1α和VEGF在siHIF-1α+TAE组肿瘤内的蛋白表达显著低于其在TAE组的肿瘤内的蛋白表达(0.29±0.07vs0.52±0.07；0.66±0.07vs0.90±0.08)(p<0.05)。HIF-1α的RNA干扰在蛋白水平上敲低TAE诱导的HIF-1α和VEGF的升高。HE染色分析结果：HIF-1α的RNA干扰使肺转移率从对照组的87.5%下降到siHIF-1α组的50%(p>0.05),从TAE组的100%下降到siHIF-1α+TAE组的50%(p<0.05)；平均每只大鼠的肺结节数从对照组的32.75±16.35下降到siHIF-1α组的7.38±8.57(p<0.05),从TAE组的42.88±13.77下降到siHIF-1α+TAE组的10.38±11.67(p<0.05)。HIF-1a的RNA干扰有效抑制TAE诱导的缺氧引起的转移。肝肿瘤体积分析结果：联合治疗组大鼠肝肿瘤体积(8162±4269mm3)显著小于siHIF-1α组(14501±4355mm3)、TAE组(15573±4191mm3)和对照组(21489±4603mm3)大鼠肝肿瘤体积(p<0.05)。HIF-1α的RNA干扰和TAE的药物相互作用系数为0.78,表示HIF-1α的RNA干扰协同TAE抑制McA RH7777肿瘤的生长。结论：HIF-1α的RNA干扰抑制TAE诱导的HIF-1α、VEGF和微血管密度的升高,减少肺转移的发生,并且与TAE以协同的方式抑制肝肿瘤的生长,显著改善TAE治疗HCC的疗效。第四部分B超引导下的缺氧诱导因子-1α的RNA干扰在大鼠模型上改善经动脉化疗栓塞治疗肝癌的研究目的：在动物模型上探索能否通过B超引导下HIF-1α的RNA干扰改善经动脉化疗栓塞(TACE)治疗HCC的疗效。方法：将野生型McA RH7777大鼠HCC细胞种植到大鼠大腿皮下,形成皮下瘤。应用皮下瘤建立大鼠肝移植瘤模型40只,将大鼠随机平均分成4个治疗组：siHIF-1α+TACE组,siHIF-lα组,TACE组和对照组。在肝脏种植瘤块15天后,在B超引导下给予siHIF-1α+TACE组和siHIF-1α组大鼠经皮穿刺瘤内注射HIF-1αRNA干扰病毒,给予TACE组和对照组瘤内注射等量阴性对照病毒。第二天接着经胃十二指肠动脉逆向插管进行TACE治疗,给予siHIF-1α+TACE组和TACE组大鼠栓塞碘化油和多柔比星,给予siHIF-1α组和对照组大鼠灌注等量的生理盐水。治疗后观察大鼠体重的变化,应用B超随访肝肿瘤大小的变化,并对大鼠的生存期进行分析。收集大鼠肝肿瘤和肺标本,分别应用免疫组织化学分析、反转录聚合酶链反应分析和HE染色对HIF-1α、 VEGF和微血管密度的表达以及肺转移情况等进行分析。结果：大鼠体重变化分析结果：术后第1周各组大鼠体重没有增加或下降的趋势；术后第2周各组大鼠体重逐渐增加；术后第3周联合治疗组大鼠体重仍继续增加,对照组大鼠体重明显下降,单一方法治疗的两组大鼠体重升高不明显,但也没有出现下降；术后第4周联合治疗组大鼠体重继续增加,单一方法治疗组和对照组大鼠体重均下降,但后者下降非常明显。大鼠生存期分析结果：各组大鼠的中位生存期分别为：siHIF-la+TACE组,40天(95%CI：37.93-42.07天)；siHIF-1α组,33天(95%CI：29.90-36.10天)；TACE组,35天(95%CI：31.90-38.10天)；对照组,30天(95%CI：28.99-31.01天)。4组大鼠生存期的Kaplan-Meier对比分析显示p<0.05,因此可以说HIF-1α的RNA干扰通过延长大鼠的生存期改善TACE对肝癌的治疗。大鼠肝肿瘤大小分析结果：根据各组肿瘤体积变化曲线说明siHIF-1α+TACE组大鼠肝肿瘤生长明显受到抑制；siHIF-1α组和TACE组大鼠肝肿瘤生长受到轻度抑制,Control组大鼠肝肿瘤生长迅速。对治疗后第四周时各组肿瘤体积进行统计分析也显示联合治疗组肿瘤体积显著小于其它三个治疗组(p<0.05)。HIF-1α的RNA干扰通过抑制肿瘤的生长改善TACE对肝癌的治疗。肺组织HE染色分析结果：HIF-1α的RNA干扰使肺转移率从对照组的90%下降到siHIF-1α组的40%(p>0.05),从TACE组的100%下降到siHIF-1α+TACE组的50%(p<0.05)；HIF-1α的RNA干扰使平均每只大鼠的肺结节数从对照组的32.80±15.85下降到siHIF-1α组的7.10±10.14(p<0.05),从TACE组的44.30±12.64下降到siHIF-1α+TACE组的11.90±13.58(p<0.05)。HIF-1α的RNA干扰通过抑制肺转移的发生改善TACE对肝癌的治疗。免疫组织化学分析结果：在siHIF-1α组,HIF-1α的敲低显著抑制肿瘤缺氧诱导的HIF-1α,VEGF,和CD31的升高(与对照组相比,p<0.05)；在siHIF-1α+TACE组,HIF-1α的敲低显著抑制TACE和肿瘤缺氧共同诱导的HIF-1α, VEGF,和CD31的升高(与TACE组相比,p<0.05)。HIF-1a的RNA干扰通过抑制TACE诱导的HIF-1α, VEGF,和CD31的升高改善TACE治疗肝癌的疗效。反转录聚合酶链反应分析结果：在siHIF-la组,HIF-1α的敲低显著抑制肿瘤缺氧诱导的HIF-1α和VEGF mRNA表达的升高(与Control组相比,p<0.05)。在siHIF-1α+TACE组,HIF-1α的敲低显著抑制TACE和肿瘤缺氧共同诱导的HIF-1α和VEGF mRNA表达的升高(与TACE组相比,p<0.05)。HIF-1α的RNA干扰通过抑制TACE诱导的HIF-1α和VEGF mRNA表达的升高改善TACE治疗肝癌的疗效。结论：B超引导下的HIF-1α的RNA干扰通过有效抑制TACE诱导的HIF-1α,VEGF,和CD31的升高,抑制肿瘤的生长、延长大鼠的生存期和降低肺转移改盖TACE治疗肝癌的疗效。