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研究背景糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）是最常见的糖尿病慢性并发症,是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）以及终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）的最主要原因之一。尽管目前的治疗措施,包括严格控制血糖、血压、血脂和限制蛋白摄入等,以及一些新型药物,对于延缓DKD的发生发展有一定的作用,但DKD发病和进展的风险仍然很大。而DKD一旦发展为ESRD,会对患者的生活质量造成巨大影响,亦加重了社会的经济负担。因此,目前迫切需要新的治疗方法来延缓DKD的发生发展,改善DKD患者的不良结局。已有研究报道,间充质干细胞在基础实验和临床实践中均表现出对DKD有良好的治疗作用,主要表现为改善肾脏功能、减少尿白蛋白、减轻肾脏纤维化等。目前广泛认为MSCs主要通过旁分泌发挥作用,外泌体作为MSCs旁分泌的主要成分,被认为是MSCs发挥作用的关键效应元件。外泌体是细胞分泌的直径在40～160nm的脂质双层膜结构的微小囊泡,通过向靶细胞运输各种信号物质,实现细胞间的信息传递。脐带间充质干细胞来源的外泌体（Mesenchymal stem cell derivedexosomes,MSC-exos）运输的物质包括蛋白质、脂质、miRNAs以及其他种类的RNAs等,其中miRNAs是外泌体实现生物学功能的重要媒介。肾小管上皮细胞凋亡和上皮间充质化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition,EMT）在DKD的发生发展中起到重要作用。有研究报道,miRNAs在其中起着非常重要的作用。基于以上研究,我们提出以下假说:1.MSCs来源的外泌体可能通过抑制肾小管上皮细胞凋亡和上皮间充质化发挥治疗DKD的作用;2.MSCs来源的外泌体可能通过递送某种miRNA作用于下游的信号分子来发挥治疗DKD的作用。研究目的探究人脐带间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exos）对糖尿病肾病肾小管上皮细胞的作用及机制。研究方法1.提取并鉴定人脐带间充质干细胞及其分泌的外泌体;2.选用荧光染料Cy7或PKH67标记外泌体,观察体内外外泌体生物分布和摄取情况;3.选用db/db小鼠作为糖尿病肾病动物模型。实验动物共分为四组,每组8只,对照组db/m小鼠和DKD组db/db小鼠每周输注PBS,MSCs或MSC-exos治疗组每周输注人脐带间充质干细胞或MSC-exos,共6周,治疗结束后2周,将小鼠安乐死,分离肾脏,一半肾脏保存于液氮中,用来提取总蛋白和总RNA,一半肾脏保存于4%福尔马林中,随后石蜡包埋、切片;4.分别于第10周龄和12周龄采集全部小鼠24小时的尿液,测尿白蛋白;5.分别通过HE染色、PAS染色、Masson染色观察小鼠肾小球及肾小管间质的组织形态学变化;6.通过Western blot、TUNEL染色、Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡;7.通过Western blot、免疫荧光染色检测肾小管上皮细胞间充质化;8.通过向 MSCs 转染 miR-424-5pinhibitor,抑制 MSC-exos 中 miR-424-5p 的表达水平,观察miR-424-5p是否介导MSC-exos对HK2细胞的保护作用;9.利用TargetScan和miRDB数据库,预测miR-424-5p下游的靶基因;10.通过双荧光素酶报告基因检测miR-424-5P与YES-associated protein 1（YAP1）的之间的关系;11.通过向HK2细胞转染pCDNA3.1-YAP1-3 ×FLAG,在HK2细胞过表达YAP1,观察YAP1是否介导MSC-exos对HK2细胞的保护作用。研究结果1.分离获得的HUC-MSCs为单层贴壁生长,细胞形态为长梭形,近似于成纤维细胞,并呈现出旋涡样聚集趋势,可成脂诱导分化成脂肪细胞,成骨诱导分化为成骨细胞。流式细胞术检测其细胞表面标记物,细胞高表达CD73和CD105,低表达HLA-DR和CD34。2.分离获得的MSC-exos,western blot结果显示其高表达外泌体标志物CD9\CD63\CD81,低表达细胞内质网标志物calnexin蛋白;电镜下呈圆盘样双层膜结构的囊泡;NTA结果显示囊泡直径中位数为121.5nm,符合外泌体一般特点。3.小动物活体成像结果显示,Cy7标记的外泌体在肾脏有很强的荧光信号;进一步用PKH67标记的外泌体荧光显像发现外泌体多集中于肾小管上皮细胞。4.HUC-MSCs及其外泌体改善了糖尿病小鼠肾脏功能的生化指标,包括减少了尿蛋白、降低了血清肌酐和尿素氮。5.HUC-MSCs及其外泌体改善了糖尿病小鼠肾脏组织病理学改变,包括抑制了肾小球增大、肾小管基底膜增厚和间质纤维化。6.Western blot、TUNEL染色结果示HUC-MSCs及其外泌体减轻了糖尿病小鼠肾脏的细胞凋亡。7.Western blot、免疫荧光染色结果示HUC-MSCs及其外泌体减轻了糖尿病小鼠肾脏的上皮间充质化。8.荧光显像结果示,HK2细胞可摄取PKH67标记的MSC-exos,被摄取的MSC-exos均匀分布在HK2细胞内。9.Western blot结果示MSC-exos抑制了高糖诱导的HK2细胞凋亡和上皮间充质化。10.qPCR 结果示 miR-424-5p 在 MSC-exos 中高表达,抑制 miR-424-5p 后,MSC-exos在高糖环境下对HK2细胞的保护作用显著减弱。11.利用TargetScan和miRDB数据库,预测YAP1为miR-424-5p下游的靶基因,双荧光素酶报告基因结果示YAP1的3’UTR存在miR-424-5p的结合位点。12.在高糖环境下,HK2细胞过表达YAP1后,MSC-exos对HK2细胞的保护作用显著减弱。研究结论1.HUC-MSCs及MSC-exos对糖尿病小鼠的肾脏具有保护作用,主要表现为其可减少小鼠尿微量白蛋白,降低血肌酐和尿素氮的水平,改善肾脏病理结构。2.HUC-MSCs及MSC-exos可缓解糖尿病小鼠肾脏细胞凋亡和EMT。3.MSC-exos可通过miR-424-5p靶向抑制YAP1,从而抑制高糖诱导的HK2细胞凋亡和EMT。