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天然免疫系统是机体抵御外来微生物抗原入侵的第一道防线。自然杀伤细胞（NK细胞）是天然免疫系统的重要组成部分,是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要的免疫调节细胞。NK细胞不表达典型的抗原识别受体,不需预先活化就能够识别并杀伤异常细胞,并迅速分泌可溶性因子包括趋化因子和细胞因子,在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥重要作用。NKT细胞也是机体天然免疫系统的重要的细胞群体,它既表达特异性的T细胞的标志,又表达NK细胞的标志,通过分泌细胞因子和杀伤功能在对感染、肿瘤、移植、自身免疫性疾病、炎症等的免疫应答中发挥重要作用。IL-2与IL-15是γc家族细胞因子的成员,它们是重要的细胞生长因子,能够调控淋巴细胞的增殖、活化和生存。虽然IL-2和IL-15受体含有相同的β和γ亚单位,能够活化下游共同的JAK-STAT等信号通路,但是在许多适应性免疫应答中,IL-2和IL-15表现出了不同的甚至相反的功能。脐血中含有大量未成熟的细胞和造血前体细胞,具有分化潜能,研究这些细胞在IL-2和IL-15作用下的发育分化情况,将有利于发现些许天然免疫细胞发育分化的线索,以及IL-2和IL-15在其中的不同作用,为以脐血天然免疫细胞为基础的生物治疗提供理论依据。NK92细胞是一种自然杀伤细胞系,具有与人活化的NK细胞相似的表型特征和功能特点,是研究NK细胞功能的很好的工具。NK92细胞无需抗原预先作用,就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,可在体外长期培养大量扩增,具有广谱抗肿瘤作用,使其成为一种有效的免疫治疗剂。我们对NK92细胞杀伤靶细胞的可能的杀伤机制进行了探索,以期为有效的NK细胞治疗的提供线索。本实验中,我们分离脐血单个核细胞,分别加入IL-2和IL-15进行培养,采用流式细胞术检测细胞的表型以及各细胞群体的比例,结合细胞计数推算各细胞群体的细胞数量;利用ELISA方法和胞内细胞因子染色技术,检测特定细胞细胞因子的分泌情况;利用Annexin V染色和胞内Bcl-2和Bcl-xL染色,分析细胞亚群的凋亡情况;利用MACS和FACS纯化细胞,检测特定纯化细胞在不同刺激因素作用下的变化情况;利用51Cr释放法检测细胞对K562细胞的杀伤活性;利用流式细胞术检测细胞与细胞的结合和细胞内信号通路的活化;利用激光共聚焦显微镜技术和荧光抗体,观察细胞-细胞之间的免疫突触,相关分子在细胞表面分布的情况以及信号分子的活化。通过上述研究方法,我们初步获得了以下结果以及结论:1.脐血NK细胞活性低与其高表达NKG2A/CD94和低表达颗粒酶B有关首先我们对脐血NK细胞的比例和杀伤功能的检测发现,尽管脐血NK细胞和CD8+ NK细胞的比例都高于外周血,但是脐血NK细胞的杀伤功能却显著低于外周血NK细胞。分析NK细胞受体的表达发现,活化性NK细胞受体CD16,NKG2D和NKp46的表达在脐血和外周血NK细胞没有差异,但是抑制性NKG2A/CD94受体的表达在脐血NK细胞明显增高。对于杀伤效应分子的检测发现,颗粒酶B在脐血NK细胞的表达明显低于外周血NK细胞,而细胞内穿孔素,IFN-γ,TNF-α的表达,以及膜表面FasL和TRAIL的表达在脐血和外周血NK细胞没有明显差异。综上所述,抑制性NKG2A/CD94受体的高表达和颗粒酶B的低表达与脐血NK细胞活性低有关系。2.IL-15抗脐血CD56dim细胞凋亡的作用与Bcl-xL有关比较分析IL-2和IL-15对脐血NK细胞的作用发现,IL-15能够促进CD56brightNK细胞和CD56dimNK细胞的增殖,而IL-2只能维持CD56brightNK细胞的生存。IL-15培养的NK细胞凋亡的比例明显低于IL-2,凋亡细胞大都为CD56dimNK细胞,而且抗IL-2的中和抗体能够协同IL-15减少NK细胞的凋亡。应用纯化的CD56dimNK细胞做进一步研究得到同样的结果。对抗凋亡蛋白的检测发现,Bcl-2的表达在IL-2和IL-15培养的CD56brighNK细胞和CD56dimNK细胞中没有明显差异;与IL-2相比,IL-15培养的NK细胞表达高水平的Bcl-xL,而目CD56brightNK细胞Bcl-xL的表达高于CD56dimNK细胞。这提示,Bcl-xL在IL-15抗NK细胞凋亡中起重要作用。此外,对IL-2Rα和IL-15Rα的检测发现,IL-15能够显著上调NK细胞IL-2Rα的表达并能更好的维持IL-15Rα的表达。综上所述,IL-2促进CD56dimNK细胞凋亡而IL-15能够抑制其捌亡,IL-15的抗凋亡作用与Bcl-xL的高表达相关。因此IL-15在维持CD56dimNK细胞的长期的功能中起重要作用。3.IL-2和IL-15对脐血NKT样细胞的发育和活化产生不同的作用利用体外长期脐血单个核细胞培养发现,CD3+CD56+ NKT样细胞由CD34-CD56-细胞发育而来,CD34+细胞和CD56+细胞在IL-2或者IL-15的作用下只能产生极少量的NKT样细胞。IL-2促进NKT样细胞增殖的能力高于IL-15;但是IL-15培养的NKT样细胞的活化程度（表达高水平的活化标志CD161,CD25和IFN-γ）高于IL-2组而凋亡比例低于IL-2组。对Bcl-xL的检测发现,IL-15培养的NKT样细胞Bcl-xL的表达高于IL-2组。综上所述,IL-2能够促进NKT样细胞增殖,但是IL-15可以更有效的活化NKT样细胞,并使其维持更高的活性。IL-15的这些作用可能与其在GVHD中的致病作用有关系。4.ERK1/2通路在以CD11a和CD2为基础的NK92细胞的杀伤中起重要作用首先利用流式细胞术能够检测到NK92细胞与靶细胞的结合,而且NK92细胞的杀伤活性与效靶细胞结合的比例有关,结合率越高,杀伤功能越强。许多因素都能影响NK92与靶细胞的结合,如抑制性NK受体的表达,细胞膜流动性的破坏,EDTA等。对细胞粘附分子的研究发现,CD11a和CD2在NK92细胞和K562细胞相互作用的界面上有聚集现象,提示二者可能在NK92细胞结合K562细胞过程中起重要作用。K562细胞与NK92细胞的相互作用能够活化NK92细胞的ERK1/2通路,抑制ERK1/2的磷酸化显著降低NK92细胞的杀伤功能。综上所述,NK92细胞结合靶细胞是其行使杀伤功能的先决条件。效靶结合活化NK细胞的ERK1/2信号通路也在NK92细胞杀伤靶细胞中起重要作用。