目的:为了研究香烟烟雾对人支气管和肺长期暴露致癌的表观遗传学机制。利用Illumina450k甲基化芯片在前期建立的香烟烟雾染毒诱导的BEAS-2B细胞恶性转化模型中检测出的异常甲基化基因,筛选出异常高甲基化基因PTPRM,探索PTPRM基因在细胞恶性转化过程中的表达改变和对细胞迁移和侵袭能力影响的机础研究,为肺癌的诊断、治疗以及预后提供新的理论依据。方法:针对香烟烟雾暴露后BEAS-2B细胞进行的Illumina450k甲基化芯片的筛选结果,并通过KEGG等生物信息学分析将异常改变的基因富集至不同的信号通路中,通过进一步文献查询和GO功能分析,筛选出异常甲基化基因PTPRM。通过特异性甲基化PCR(MSP)验证其在香烟烟雾致恶性转化细胞中的DNA甲基化改变,最终确定PTPRM基因作为研究对象。培养本课题组前期建立的香烟烟雾染毒致恶性转化的细胞,以未暴露在香烟烟雾中的BEAS-2B传代40代细胞(2B-40)为对照组,以染烟1代、10代、20代、30代传代40代细胞(S1-40、S10-40、S20-40和S30-40)为染毒组,利用Q-PCR和Western blot检测PTPRM基因在对照组与染毒组的mRNA和蛋白表达,利用甲基化抑制剂5-aza-2’-dC处理染毒组细胞后检测PTPRM基因的表达改变,观察甲基化改变对表达的影响;检测对照组以及染毒组各代细胞迁移和侵袭能力的改变,同时分析与迁移和侵袭能力相关的蛋白CDH1的表达改变以及β-catenin的磷酸化改变;将对照组细胞中PTPRM基因敲除后,检测细胞迁移和侵袭能力的变化以及CDH1的表达改变以及β-catenin的磷酸化改变,用以确定PTPRM的甲基化改变以及其影响的表达改变对细胞生命活动的影响及其机制。结果:(1)利用甲基化芯片结果,通过KEGG生物信息学分析,将甲基化改变的基因富集至不同的信号通路中,富集到基因最多的信号通路分别是Axon guidance、NOD-like receptor signaling pathway、Cell adhesion molecules(CAMs)和Cytokine-cytokine receptor interaction,在根据生物信息分析和文献查询,筛选出PTPRM基因,MSP结果显示其在恶性转化实验组细胞中出现了异常高甲基化。PTPRM基因的mRNA和蛋白水平表达在染毒组中表达下降,并随着染毒代数的增加而表达逐渐下降。5-aza-2’-dC处理实验组细胞后,染毒各代细胞中PTPRM的表达出现不同程度的恢复,表明PTPRM基因的表达受到异常甲基化的调控。(2)Transwell迁移和侵袭实验结果显示,与对照组相比,染毒组各代细胞的迁移和侵袭的细胞数量增加,并随着恶性转化程度升高,迁移和侵袭能力逐渐增强。将对照组细胞中PTPRM基因敲除后,PTPRM敲除细胞的迁移和侵袭能力增强,并具有统计学意义,说明PTPRM基因在细胞中可以影响细胞的迁移和侵袭能力。(3)筛选出PTPRM基因可能影响的下游基因CDH1和β-catenin,Q-PCR和Western blot检测发现在基因和蛋白水平,CDH1的表达都随着染毒代数的增加而降低,而β-catenin的磷酸化水平随着染毒代数增加而增强;在敲除了PTPRM基因,两者也出现了相同的改变,证明在PTPRM基因的表达改变调控着CDH1基因的表达改变以及β-catenin的磷酸化水平,从而调控细胞迁移和侵袭功能的改变。结论:1、甲基化芯片筛选出恶性转化细胞中的甲基化特异性升高的PTPRM基因,该基因表达受到异常甲基化的控制,随着染毒代数的增加,PTPRM基因的表达逐渐降低,存在剂量-效应关系。2、PTPRM基因可以调节下游CDH1基因的表达,且呈正相关,随着PTPRM基因表达降低,CDH1基因的表达也逐渐降低;同时PTPRM基因可以影响β-catenin的蛋白酪氨酸磷酸化,随着PTPRM基因表达降低,β-catenin的磷酸化程度增强。3、PTPRM基因通过调节CDH1的表达和β-catenin的磷酸化来调控细胞迁移和侵袭能力的改变。