病毒性出血热(Viral hemorrhagic fevers, VHFs)是一组临床症状主要表现为发热和出血的急性传染病,多为突然发生,临床过程凶险,病死率高,最高可达90%。可引起VHFs的病毒种类繁多,新的病毒也不断被发现,出血热病毒涵盖了布尼亚病毒科、黄病毒科、丝状病毒科和和沙粒病毒科中的数十种病毒,其中多种病毒具有作为生物武器的潜在危险,危害严重；除个别病毒外,大部分没有有效的疫苗和治疗手段。病毒性出血热发病初期的临床症状相似,类似流感。因此,建立快速、简易、灵敏和特异的实验室检测方法对及时进行临床诊断救治、开展流行病学调查并最终控制其传播流行具有重要意义。基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)发展起来的套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等已经越来越多的应用到传染病的检测中。荧光定量PCR的最大优点是：1、灵敏度高,采用探针更能增加反应的特异性；2、使用参考的参考品,可以对靶基因进行绝对或相对定量分析；3、在全封闭的反应系统中进行基因扩增和分析,污染小；4、在PCR反应后无需电泳和成像处理,省时、便利和快捷：5、不同波长荧光基团标记后可实现多重检测。TaqMan探针标记方法是目前应用最为广泛的荧光定量PCR技术。病毒性传染病的核酸检测多是在一个独立的反应体系中进行源于临床标本的一种或一组相关病毒的核酸扩增检测。但是,在新发或罕见传染病发生时,往往需要进行多个病原体的逐一排查和确定,致使在实际检测过程中常常面临样本量不足的问题。因此,在病毒性传染病尤其是罕见或新发传染病的实验室诊断过程中,需要建立一种对有限临床标本的病原体核酸高保真和非特异性扩增的方法,以满足多病原体筛查所必需的样本量需求。多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA)是一种基于随机引物和Phi29DNA聚合酶的体外等温扩增技术,主要应用于人类和细菌的全基因组扩增,在病毒基因组扩增中的应用相对较少,特别是RNA病毒,在核酸检测过程中需要经过逆转录为DNA的过程,通常利用随机引物获得的病毒cDNA片段长度不一、大小有限,影响扩增的效率。本课题的目的是建立基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR (TaqMan multiplex real time RT-PCR)方法以检测主要的出血热病毒,以及利用多重置换扩增技术摸索RNA病毒基因组的扩增方法。1.病毒性出血热多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立通过GenBank数据库获得31种(型)病毒的全基因序列(包含基孔肯雅病毒),使用Bioedit软件进行比对和分析后确定保守区域,体外转录合成靶基因的RNA模板,在统一PCR反应条件的前提下设计引物和TaqMan探针并在多重组合的条件下对引物和TaqMan探针之间的相互影响进行评价,通过Blast程序初步分析各引物-探针对检测的特异性。利用RNA参考品进行单重荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度,检出限在50～150copies/PCR;在病毒科内对引物-探针对之间的交叉反应进行验证,各引物-探针对与其他病毒均无明显扩增,表明具有良好的特异性；在多重荧光定量RT-PCR的条件下,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度,与单重条件下的结果无明显差异,并通过重复性实验验证各体系的稳定性；利用部分临床血清样本和动物组织样本对方法的实用性进行初步评价。2.基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法的研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒登革病毒的培养上清为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法进行绝对定量,以比较各种方法对RNA病毒核酸的扩增效果差异。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍；在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2x105倍,尤其是对含低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。