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第一部分 MiR-17-5p和130b-3p在胶质瘤干细胞中的表达及与HIF-1α的关系背景与目的:恶性胶质瘤的放射治疗效果并不理想,这可能与胶质瘤干细胞在辐照后产生的微小RNA(microRNA,miR)增加了乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α的表达有关。本研究将比较SU3和SU3-5R胶质瘤干细胞中,miR-17-5p、miR-130b-3p和HIF-1α表达的差异,同时也观察SU3胶质瘤干细胞在辐照后的miR-17-5p、miR-130b-3p 和 HIF-1α表达变化,其目的是探讨 miR-17-5p 和 130b-3p 与 HIF-1α表达及细胞耐放射之间的关系。方法:将SU3和SU3-5R胶质瘤干细胞分别接种于6孔培养板中,培养24 h后收集细胞,然后提取细胞中的总RNA和蛋白,用于测定miR-17-5p、miR-130b-3p和HIF-1αmRNA或蛋白的表达。另外,将SU3胶质瘤十细胞分为对照组和放射组,培养24h后放射组给予辐照8 Gray,提取和收集辐照后6、12和24h细胞中的总RNA和蛋白,然后测定miR-17-5p、miR-130b-3p和HIF-1αmRNA或蛋白的表达。结果:与SU3细胞组相比较,SU3-5R细胞组的miR-17-5p、miR-130b-3p和HIF-1αmRNA或蛋白的表达均显著增加(P<0.01)。SU3细胞经8Gray辐照后的12和24 h,与对照组相比较,细胞中的miR-17-5p、miR-130b-3p和HIF-1α mRNA或蛋白的表达也均明显增加(P<0.05或P<0.01)。结论:SU3-5R细胞中的miR-17-5p、miR-130b-3p和HIF-1α表达较SU3细胞更多,辐照SU3细胞能够增加 miR-17-5p和130b-3p的表达,并与HIF-1α的表达相一致,提示这二个miR与SU3细胞的耐放射产生存在着一定的相关性。第二部分 MiR-17-5p和130b-3p介导胶质瘤干细胞的耐放射作用及其信号通路背景与目的:前面的研究结果显示,辐照能够增加miR-17-5p、miR-130b-3p和耐放射相关的HIF-1α表达。本研究将利用miR-17-5p或miR-130b-3p模拟物或抑制物转染的SU3细胞,进一步证实这二个miR与SU3细胞耐放射的关系及其可能的信号通路。方法:将SU3细胞分别给予转染miR-17-5p和130b-3p的模拟物或者抑制物,24 h后进行10 Gray辐照,然后用MTT法测定辐照后0、12和24 h的细胞存活率;或将分别转染miR-17-5p或miR-130b-3p模拟物或抑制物的SU3细胞,培养36 h后测定上清液中葡萄糖、细胞内6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)、6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)、还原型辅酶 Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathion,GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量,同时也测定细胞内的HIF-1α和同源磷酸酶与张力蛋白(phosphataseand tensin homolog,PTEN)mRNA 和蛋白表达、葡萄糖转运体(glucose transporter,GLUT)-1、GLUT-3、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和p-AKT的蛋白表达。借助生物信息学方法预判miR-17-5p和130b-3p作用的可能靶基因,并比较SU3和SU3-5R细胞中该靶基因的mRNA和蛋白表达,然后用荧光素酶报告基因方法分别检测miR-17-5p和130b-3p与靶基因的结合。结果:转染miR-17-5p或miR-130b-3p模拟物后的SU3细胞,在辐照10 Gray后12和24h的细胞存活率明显增加(P<0.05),而转染miR-17-5p或miR-130b-3p抑制物的SU3细胞,在辐照10 Gray后12和24 h的细胞存活率则明显降低(P<0.05)。在转染miR-17-5p或miR-130b-3p模拟物后的SU3细胞中,细胞内的HIF-1α、GLUT-1、GLUT-3、AKT和p-AKT蛋白表达明显增加(P<0.05),细胞内的G6PDH、6PGDH、NADPH、GSH-Px和GSH含量也明显增加(P<0.05或P<0.01),但细胞中的PTEN表达和培养上清液中葡萄糖含量则明显降低(P<0.05),而在转染miR-17-5p或miR-130b-3p抑制物后的SU3细胞中,则可逆转这些作用。在耐放射的SU3-5R细胞中,PTEN mRNA和蛋白的表达也明显低于SU3细胞(P<0.05或P<0.01)。生物信息学方法预测到PTEN是miR-17-5p或miR-130b-3p作用的重要靶基因之一,荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-17-5p mimic或miR-130b-3p mimic可使PTEN3’非编码区野生型组的荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。结论:MiR-17-5p和130b-3p参与了SU3细胞耐放射的产生,其介导机制与PTEN/HIF-1α信号通路调控的葡萄糖跨膜转运和磷酸戊糖途径代谢增强后的抗氧化物增加有关。第三部分 HIF-1α抑制剂牡荆苷增加SU3细胞及其移植瘤的放射敏感性背景与目的:前文的研究结果显示,miR-17-5p和130b-3p可通过作用于PTEN/HIF-1α信号通路,增强磷酸戊糖代谢途径而诱发放射耐受。本研究将观察HIF-1α抑制剂牡荆苷对SU3细胞及其移植瘤是否可产生放射增敏效应,并探讨其可能的机制。方法:在体外,将转染miR-17-5p或miR-130b-3p模拟物的SU3细胞,用25-100μM牡荆苷处理24 h 后辐照10 Gray,12 h后用MTT法测定细胞的存活情况。同样地,用50-200 μM牡荆苷处理SU3-5R细胞24 h后,MTT法测定辐照10 Gray后的细胞存活情况。采用real-timePCR方法,分别测定SU3和SU3-5R细胞经25-100μM牡荆苷处理24h后的miR-17-5p和130b-3p表达。在体内,将SU3细胞接种于裸小鼠的左足掌中,28天后按肿瘤体积随机分成3组:即对照组、放射组、牡荆苷+放射组。后一组小鼠每天给予腹腔注射牡荆苷75 mg/kg,前二组小鼠则给予腹腔注射等体积5%甲基亚砜溶液。后二组放射处理的小鼠,则在给予牡荆苷后的第3、10和17天,采用高能X线(直线加速器),局部照射肿瘤10 Gray/次,共3次。在末次照射4天后,收集禁食12 h的小鼠血液和肿瘤组织,用于相关指标的测定。整个实验治疗周期为21天。结果:在miR-17-5p或miR-130b-3p模拟物转染的SU3细胞上,用牡荆苷预处理24 h后,SU3细胞在辐照后的存活率降低,尤其是50和100μM组的作用更为明显(P<0.05或P<0.01)。经牡荆苷50和100μM预处理24 h的SU3-5R细胞,在辐照后的存活率也明显降低(P<0.05或P<0.01)。不管是SU3细胞还是SU3-5R细胞,用牡荆苷50和100 μM处理24 h后,细胞内的miR-17-5p和130b-3p表达均明显降低(P<0.05 或 P<0.01)。用牡荆苷治疗21天的SU3足掌移植瘤小鼠,与单纯放射组相比较,肿瘤体积和重量、肿瘤组织中的GSH和GSH-Px含量、miR-17-5p和130b-3p表达、以及HIF-1 α、GLUT-1、GLUT-3和血管内皮生长因子蛋白表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),而肿瘤组织中的PTEN蛋白表达则显著升高(P<0.01)。结论:牡荆苷可增加SU3细胞及其移植瘤的放射敏感性,其机制可能与降低miR-17-5p和130b-3p靶向PTEN的抑制作用后,削弱HIF-1α调控的葡萄糖跨膜转运、磷酸戊糖代谢以及抗氧化物生成有关。