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SPSB(SPRY domain containing SOCS box)家族是指一类包含SPRY结构域和羧基端SOCS box结构域的分子。高等动物SPSB家族由四个成员(SPSB1-SPSB4)组成,能介导NO合成,调节干扰素调节因子诱导干扰素的产生,在生长发育、免疫防御等生命活动中发挥重要作用。目前,在果蝇等无脊椎动物中也发现了SPSB家族分子,但对其生物学作用特别是免疫学功能仍知之甚少。本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,利用分子免疫学、细胞生物学、生物信息学等技术手段,分析了长牡蛎SPSB家族成员的结构特征,研究了SPSB与诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的作用模式及其对白细胞介素17(CgIL17-5)、肿瘤坏死因子(CgTNF-1)、类干扰素(CgIFNLP)等细胞因子合成的诱导作用,初步揭示了长牡蛎SPSB家族调节免疫应答的机制。长牡蛎SPSB家族共包含两个成员,CgSPSB1和CgSPSB3。CgSPSB1和CgSPSB3基因的开放阅读框全长分别为837 bp和699 bp,编码279和232个氨基酸。CgSPSB1和CgSPSB3的结构域高度保守,均包含一个典型的SPRY结构域和一个典型的SOCS box结构域。CgSPSB1与模式生物(如人、小鼠、斑马鱼和果蝇)具有70%以上的序列相似性。通过构建系统进化树分析,高等动物中SPSB1、SPSB4先聚为一簇,后与长牡蛎中CgSPSB1聚为一簇,最后与果蝇中的GUSTAVUS(GUS)聚在一起。CgSPSB3与美洲牡蛎、虾夷扇贝、鲎和果蝇等无脊椎动物的SPSB3序列具有50%以上的相似性,与脊椎动物的SPSB3相似性较低。系统进化树中,CgSPSB3与其他物种中的SPSB3聚为一大支,SPSB1/2/4聚为一大支。CgSPSB1和CgSPSB3的mRNA转录本在长牡蛎各类组织中均呈组成型表达,并且都在血淋巴细胞中具有最高的表达量。亚细胞定位实验结果显示,CgSPSB3蛋白主要表达于长牡蛎血淋巴细胞的细胞质中。脂多糖(LPS)刺激12 h后,长牡蛎血淋巴细胞中的CgSPSB1和CgSPSB3 mRNA表达量均显著升高,分别为对照组的2.06倍(p<0.05)和2.71倍(p<0.05)。灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激后,血淋巴细胞中CgSPSB3 mRNA表达量在3 h开始升高,24 h达到最高峰,为对照组的5.03倍(p<0.05)。利用原核表达技术分别表达了CgSPSB1蛋白和长牡蛎NOS(CgNOS(1-370aa))蛋白,利用Pull down方法验证了二者的体外结合活性。结果表明,rCgSPSB1不具有体外结合rCgNOS(1-370aa)的活性。生物信息学分析发现,CgSPSB1的SPRY结构域含有一个与D-I-N-N-N序列结合的保守氨基酸位点Tyr133,而Cg SPSB3不含该位点。CgNOS的氨基端不含有与CgSPSB1发生特异性结合的D-I-N-N-N氨基酸序列。该结果表明,与高等动物同源分子不同,长牡蛎CgSPSB1无法通过与CgNOS相互作用调节NO的合成。利用Pull down方法分别检测了rCgSPSB1和rCgSPSB3与长牡蛎CgIRF-8的体外结合活性。结果表明,rCgSPSB1和rCgSPSB3均具有与CgIRF-8结合的活性,说明其可能参与调节IFN的合成。同时,利用dsRNA干扰方法体内敲减CgSPSB3的表达,发现长牡蛎血淋巴细胞中CgIFNLP、CgIL17-5和CgTNF-1的mRNA表达水平显著降低。表明长牡蛎CgSPSB3能够介导IFN、IL17和TNF等细胞因子的合成,在固有免疫应答中发挥重要作用。以上研究结果表明,长牡蛎CgSPSB1和CgSPSB3结构保守,均含有一个典型的SPRY结构域和一个典型的SOCS box结构域。rCgSPSB1和rCgSPSB3均具有结合CgIRF-8的活性,且CgSPSB3能够调节血淋巴细胞合成IFN、IL17、TNF等细胞因子。由于长牡蛎CgNOS不具备高等动物iNOS中的D-I-N-N-N序列,CgSPSB1无法通过与CgNOS相互作用调节NO的合成。本研究初步阐明了长牡蛎SPSB分子在固有免疫应答中的作用,同时也为无脊椎动物SPSB家族的免疫调节机制提供了参考。