红花(Carthamus tinctorius L.)作为传统中药,用途十分广泛。红花种子亚油酸含量是所有已知植物中最高的,可达70%以上。已有研究表明红花材料可按其种子亚油酸含量的不同分为高、中和低亚油酸三种类型。亚油酸为人体必需脂肪酸,具有降低血液粘胆固醇含量及血液粘稠度,预防心脑血管疾病等作用。另外不饱和脂肪酸是植物细胞膜的重要组成成分,在植物抵抗外界生物和非生物胁迫中发挥重要作用。不饱和脂肪酸在植物体内的生物合成是由脂肪酸合酶系统和一系列脂肪酸去饱和酶催化完成的,近年来,该合成途径中许多关键酶基因已被成功克隆和分析,但外源激素对红花脂肪酸积累模式及相关基因表达量的影响仍未见报道,低温对红花脂肪酸和相关基因表达量的影响的研究也不够全面,值得进一步深入研究。为此,本试验一方面用不同浓度赤霉素和多效唑喷施伸长期红花植株,另一方面对不同种子脂肪酸组成类型的红花材料分别在蕾期和苗期进行了低温处理,采用气质联用(GC/MS)法检测其不同器官的脂肪酸组成及含量变化,并利用实时荧光定量PCR技术(Q-PCR)对不同发育阶段种子脂肪酸生物合成途径部分关键酶基因包括乙酰CoA羧化酶基因(ACC)、β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ基因(KASⅡ)、△9-脂肪酸去饱和酶基因(SAD)、ω-6脂肪酸去饱和酶基因(FAD2的7个不同拷贝、FAD6)的表达量进行分析。主要研究结果如下:1.分别采用三种浓度的赤霉素(30、100、170 mg/L)及其生物合成抑制剂--多效唑(30、90、150 mg/L)对伸长期的高亚油酸类型红花材料PI 544021进行喷施处理。结果表明,在本试验条件下,赤霉素处理可显著增加红花PI544021的株高和分枝长,降低其单株总果球数和一级分枝数,并使始花期提前1～4 d;多效唑处理则显著降低其分枝长,使始花期延迟1～2d,但对其余性状影响均不显著。赤霉素和多效唑对叶片和花器官的脂肪酸组成及含量影响相对较小,但对其种子油酸以及亚油酸含量有明显影响。其中,30 mg/L赤霉素使PI 544021种子亚油酸含量达67.83%,比对照提高5.25%,增幅为8.39%;150 mg/L多效唑使油酸含量达到20.05%,比对照提高4.81%,增幅为31.56%,并显著提高开花后20d种子的油酸/亚油酸(O/L)值。利用QPCR技术对30 mg/L赤霉素和150 mg/L多效唑处理过的上述材料种子脂肪酸生物合成途径关键酶基因的表达量进行检测。结果表明,种子发育过程中,CtFAD2-3和CtFAD2-6基因在花后10 d和15 d时表达上调,而其余基因在种子各发育时期表达较为稳定。30mg/L赤霉素处理后,开花当天的子房中各基因表达量均有不同程度提高;在花后5 d种子中,各基因表达量很低;在开花后10d种子中,CtKASⅡ、CtSAD、CtFAD2-1基因表达量明显增加,其余基因表达量均下降;在开花后15 d种子中,各基因表达量很低,明显低于其他时期;开花后20 d种子的CtKASⅡ、CtSAD、CtFAD2-1基因的表达量进一步增加,CtFAD2-8基因在20 d时表达量也明显增加,CtFAD2-2和CtFAD6表达量较低。150 mg/L多效唑处理后,开花当天的子房中,基因表达量相对较低;在花后5 d种子中,各基因表达量很低;在10 d种子中,CtSAD和CtFAD2-1基因表达量增加,CtKASⅡ基因表达量变化不大,而其余各基因表达量均不同程度下降;在开花后15 d种子中,各基因表达量很低,明显低于其他时期;各基因在20 d种子中的表达量均高于其他时期。2.分别对低亚油酸类型红花材料PI401479和高亚油酸类型红花材料PI544021的2月龄幼苗进行4℃、10℃、16℃、24℃四种温度处理,在处理的0 h、1d、2d、4 d、12 d分别采集幼苗的根、茎、叶,采用GC-MS测定各组织脂肪酸组成和含量。结果表明,在叶片中,4℃和10℃处理使低亚油酸红花材料的亚油酸和亚麻酸先逐渐上升,而在4 d后降低。16℃和24℃处理使两种不饱和脂肪酸含量快速下降。四种温度处理均使其饱和脂肪酸含量有不同程度增加。在高亚油酸红花材料中,4℃低温处理使叶片的亚油酸和亚麻酸含量增加,10℃处理后两种不饱和脂肪酸在0h～2d增加而后不断降低。16℃、24℃处理使其亚油酸和亚麻酸含量逐渐降低。4℃、10℃处理使棕榈酸含量降低,16℃、24℃使棕榈酸含量增加,硬脂酸含量在四个温度处理下均表现为增加。但各温度处理下对两种红花材料根和茎脂肪酸含量和组成影响相对较小。以上结果表明,低温有利于红花叶片亚油酸和亚麻酸的积累,而较高的温度可提高其棕榈酸和硬脂酸含量。且不同类型红花材料及不同组织对温度的响应各不相同。3.分别对低亚油酸类型PI 470942、中间型PI 401477和高亚油酸类型PI 544021红花材料进行蕾期低温(12℃)处理。结果表明,在叶片中,低温处理2 d对中间型红花材料脂肪酸含量影响较小;但极显著提高了低亚油酸红花材料亚麻酸含量;显著降低了高亚油酸红花材料亚麻酸含量,极显著提高了其棕榈酸含量。在花器官中,低温处理显著降低了中间型红花材料亚油酸含量;极显著增加了低亚油酸材料亚麻酸含量,而棕榈酸含量极显著降低;在高亚油酸材料中,亚油酸和亚麻酸含量均显著增加。在种子中,低温处理使中间型材料亚油酸和油酸含量增加,且使花后0～15 d种子油酸含量积累加快;低温处理显著降低了低亚油酸材料亚油酸含量,但促进了油酸含量的快速提高;低温处理使高亚油酸材料的20～25 d种子亚油酸含量降低,而油酸含量增加。SAD是催化合成油酸的关键酶,FAD2是植物合成亚油酸的关键酶。在红花中,CtFAD2-1是负责红花种子亚油酸合成的主要关键酶基因。利用QPCR技术对经过和未经低温处理的三种类型红花材料种子中脂肪酸生物合成途径关键酶基因的表达量进行检测,并测定同期种子脂肪酸组成及含量。结果表明,各关键酶基因在不同材料中表达情况各不相同。未经低温处理时,中间型材料中CtFAD2-3和CtFAD2-6表达量在种子发育前期较高;低亚油酸材料中,除CtFAD2-3和CtFAD2-6表达量较高外,CtFAD2-4和CaFAD2-5在10 d的种子中也有较高表达;而在高亚油酸材料中,与前两份材料明显不同的是在25 d种子中CtFAD2-1有较高表达。低温处理后,中间型红花材料花后5 d的种子中除CtKASⅡ,其余基因表达量均有增加;花后10 d种子中部分基因表达量明显增加,其中基因CtFAD2-2、CtFAD2-3、CtFAD2-6表达量增加明显,CtFAD2-1基因表达量变化较小;在15d种子中CtFAD2-4和CtFAD2-5基因表达量明显上调;在20 d种子中,基因CtFAD2-2、CtFAD2-6、CtFAD2-8基因表达量均上调3倍以上;花后25 d种子中,基因CtFAD2-1和CtFAD2-3表达量上调;而CtSAD在花后5-15d表达量逐渐上升,在25d表达量明显提高。这在一定程度上可以解释低温下中间型红花种子中亚油酸和油酸含量均有增加,但油酸含量增加较明显,且低温处理使油酸在5～15 d积累明显加快的结果。在低亚油酸材料中,开花当天的子房和花后5 d的红花种子中各基因表达量受低温影响较小,表达量均较低;开花10 d种子中,除CtFAD2-8基因的表达量略高于对照外,其余基因的表达量均低于对照组;在15 d种子中,CtACC、CtKASⅡ、CtSAD、CtFAD2-1、t2 表达量均增加,尤其是种子特异表达的CtFAD2-1受低温影响而高表达;在20 d种子中,所有基因的表达量均低于对照;而在25 d种子中,CtFAD2-3、CtFAD2-4、CtFAD2-5、CtFAD2-6基因mRNA积累量明显增加,其余基因表达量较低,尤其是CtFAD2-1基因表达量极显著低于对照,仅为对照表达量的0.03倍。这与低亚油酸材料在低温处理后,10～15 d亚油酸含量的增加变得缓慢,于花后15 d达到高峰后又逐渐下降的结果一致;其CtSAD基因表达量变化情况也与花后15 d油酸含量急剧增加,显著高于对照,之后CtSAD表达量略低于对照,花后25 d时中间型红花材料种子的油酸含量与对照间无显著差异的结果基本一致。在高亚油酸材料中,花后10 dFAD2基因家族的表达量表现为明显下调,而CtSAD与CtKASⅡ基因的表达量与对照接近;花后15 d种子中,除CtFAD2-2基因表达量增加较小,其余FAD2基因均明显上调;花后20d种子中,CtFAD2-1,CtFAD2-8,CtKASⅡ和CtSAD基因的mRNA的积累量很高,尤其CtFAD2-1表达量,而在25 d时表达量与对照间差异相对较小,其中CtFAD2-1与对照间无显著差异。从种子脂肪酸组成来看,低温处理使花后10～20 d种子亚油酸含量积累加快,随着进一步发育,在20～25 d时,亚油酸含量有所下降,这与上述基因表达量变化结果也基本一致。综上,低温处理后,不同类型红花材料以及不同器官中脂肪酸含量变化差异明显。红花种子脂肪酸含量的变化与脂肪酸生物合成途径的关键酶基因,尤其CtFAD2-1和CtSAD的表达量变化存在相关性,不同类型红花材料种子对低温的应答反应不尽一致,可通过不同的调控方式来影响其脂肪酸合成,这进一步完善了我们关于红花对低温应答机制的研究。