背景:细胞死亡方式主要分为程序性细胞死亡和坏死,而程序性细胞死亡(programmedcelldeath)又可分为两型:Ⅰ型即为凋亡,Ⅱ型是自噬。自噬是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。细胞自噬是一把双刃剑:一方面,当细胞处于如饥饿、低氧等营养应激时,可通过适度的自噬降解自身细胞器满足生存基本物质与能量需求。在这种情况下,自噬对细胞是保护作用;另一方面,当细胞在某些药物的诱导或者刺激下,过度自噬又将导致细胞发生自噬性死亡。化香树果序为胡桃科植物化香树的干燥果序,主要产于陕西、华南、西南各省,分布于甘肃、陕西、河南及长江以南各省。化香树果序味辛,性温,具有清热解毒、活血化瘀、清肿排毒、通窍止痛的功效,是中国传统医学用于治疗鼻窦炎以及伤风鼻塞、鼻窒(急慢性鼻炎)的主要用药,临床用其汤剂治疗鼻咽癌。鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是指发生于鼻咽部的恶性肿瘤。鼻咽癌是我国南方最常见的恶性肿瘤之一,尤以广东、广西、湖南、福建和江西等五省为高发区。发病年龄大多为30-50岁中年人,亦有青少年患病者。鼻咽癌恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移和颅神经转移。目前鼻咽癌的治疗仍以放疗为主,辅以化疗、手术治疗等,只能使5年生存率达到50%～70%,然而鼻咽癌放疗后肿瘤复发、放射抗拒、化疗耐药和放化疗毒副反应严重影响治疗效果。因此,寻找对鼻咽癌治疗更有效、毒副反应更小的药物,提高疗效是目前临床治疗迫切需要解决的问题。我国传统中医药是千百年来人们在生活、疾病中不断总结、不断筛选而得。经过多年临床实践和基础研究发现多种中草药具有抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用机制主要为诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和调节细胞信号内转导等。近年来对细胞自噬在肿瘤发生与发展中的作用,以及自噬作为抗肿瘤药物作用机制的研究有了较大进展,特别是某些中药及有效成分如姜黄素、苦参碱、雷公藤内酯等能诱导肿瘤细胞自噬,自噬已成为肿瘤研究的一个新热点。已知文献中虽有提及化香树提取物具有细胞毒性、抑制肠道内有害菌生长、抗氧化、预防癌症和抗衰老作用,以及化香树作为复方中药成分治疗急慢性鼻炎、鼻窦炎,但未见化香树果序诱导鼻咽癌细胞自噬的相关文献报道。本课题是在民间中草药基础上,通过体内外实验确定了化香树果序醇取物可能通过诱导鼻咽癌细胞自噬发挥抗肿瘤作用,也是首次对化香树果序抗鼻咽癌作用及机制进行初步研究。方法:醇回流法提取化香树果序的有效成分;MTT法检测化香树果序醇提物的细胞毒性;光学显微镜下进行形态学观察并拍照记录;用流式细胞术检测细胞周期;用AnnexinV/PI双染色法检测凋亡;MDC荧光染色后在倒置荧光显微镜观察自噬小体的多寡;用透射电子显微镜观察自噬小体的形成;Western Blot检测LC3、Akt和PTEN的蛋白表达;建立人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,并连续灌胃给药;HE染色观察裸鼠皮下移植瘤的形态特征;用免疫组化法检测裸鼠移植瘤瘤体中微管相关蛋白轻链 3(microtubule-associated protein light chain 3,MAPLC3)的表达;RT-PCR 检测 mTOR、Akt、PTEN 和 Beclin1 的 mRNA。结果:第1部分化香树果序有效成分的提取1.1 化香树果序醇提物提取率取生药材化香树果序4.5kg,得化香树果序乙醇总提取物180g,出膏率为4.0%。1.2 化香树果序醇提物的有效成分通过高效液相色谱技术对化香树果序醇提物进行分析,结果发现化香树果序醇提物中的主要成分为酚酸或黄酮类成分,还可能含有萜类或挥发油类成分。1.3 化香树果序挥发油的提取率本实验采用水蒸气蒸馏法从化香树果序中提取挥发油,其得率为0.12%。1.4 化香树果序挥发油的有效成分GC-MS分析结果表明我们从提取得到的化香树果序挥发油中分离并鉴定了28个化合物,占挥发油总量的94.10%,其中脂肪酸类化合物7个,占总挥发油的71.43%,为化香树果序挥发油的主要成分类型;萜类化合物21个,占总挥发油的22.67%。以(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(44.48%)、十六烷酸(23.30%)和斯巴醇(3.20%)等化学成分含量较高。第2部分化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌细胞自噬2.1 化香树果序醇提物对CNE1和CNE2细胞增殖的影响人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞经不同浓度化香树果序醇提物处理24h、48h后,MTT结果提示化香树果序醇提物对CNE1、CNE2细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖关系;当化香树果序醇提物浓度为25mg/ml时,对CNE1、CNE2细胞的增殖抑制效果最明显;当化香树果序醇提物作用于CNE1、CNE2 48h 时,IC50 分别为 8.78mg/ml 和 15.56mg/ml。2.2 细胞形态学观察根据MTT实验结果,我们选取浓度为25mg/ml化香树果序醇提物作用于人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h后,光镜下进行细胞形态学观察发现,随着药物作用时间的延长,细胞先胀大后缩小、变圆及折光性减弱,胞质可见明显空泡化,并出现细胞间隙增宽,细胞裂解,细胞集落减少等现象,证实化香树果序醇提物对人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞均具有杀伤作用。2.3 化香树果序醇提物对细胞周期的影响25mg/ml化香树果序醇提物处理CNE1和CNE2细胞24h、48h后,细胞周期中G0/G1期细胞减少,S期细胞增多;在整个实验中,我们均没有检测到亚G1期凋亡峰的出现,这说明经过化香树果序醇提物处理后,细胞并没有发生凋亡。2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率25mg/ml化香树果序醇提物作用于人鼻咽癌细胞CNE2 24h和48h后,我们进一步用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果发现,与对照组相比,早期凋亡率稍增加,这说明化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌细胞CNE1和CNE2死亡的主要方式并非凋亡。2.5 化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞自噬MDC染色:发现人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞经25mg/ml化香树果序醇提物处理24h、48h后,细胞内荧光的强度和数量均较对照组显著上升,这个结果表明化香树果序醇提物可诱导自噬溶酶体的聚集。透射电子显微镜观察:经25mg/ml化香树果序醇提物干预CNE1和CNE2细胞10h后,细胞质内有大量空泡状双层膜包绕的自噬体和自噬溶酶体。Western Blot结果显示:随着化香树果序醇提物浓度增加,人鼻咽癌CNE1和CNE2细胞内自噬特异性相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平明显升高。这些结果表明化香树果序醇提物在体外能诱导人鼻咽癌细胞自噬。第3部分化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌细胞自噬的在体治疗研究3.1 CNE2鼻咽癌荷瘤裸鼠的一般生长状况实验结束时各组荷瘤裸鼠生长状况良好,无一例死亡,各组裸鼠体重和移植瘤体积均呈增加趋势,但生长速率各不相同。在整个实验过程,我们并没有观察到明显的毒副作用,如腹泻、活动迟缓、厌食等症状。各组移植瘤瘤体呈球形或不规则团块状,边界清楚,活动度尚可,质韧。3.2 化香树果序醇提物对裸鼠体重的影响在整个实验过程中,对照组与实验组裸鼠的体重均增加,其差异无统计学意义(P>0.05)。3.3 化香树果序醇提物对裸鼠移植瘤生长的抑制作用整个实验结束时,各组移植瘤体积:对照组为(2055.19±876.93)mm3,高浓度药物组为(1504.68±310.76)mm3,中浓度药物组为(1165.62± 72.46)mm3,低浓度药物组为(1338.49±275.10)mm3。各组瘤重:对照组为(1.88±0.24)g,高浓度药物组为(1.22±0.18)g,中浓度药物组为(0.76±0.26)g,低浓度药物组为(1.13±0.29)g。通过统计学分析,我们发现中浓度药物组的平均瘤重,瘤体积与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。同时,各浓度药物干预组其瘤重抑瘤率分别为:高浓度药物组为35.11%,中浓度药物组为59.57%,低浓度药物组为39.89%。这些结果提示化香树果序醇提物在体内对鼻咽癌细胞的生长具有抑制作用,且以中浓度药物组抑制肿瘤生长的效果最明显。3.4 HE染色观察裸鼠皮下移植瘤的形态特征HE染色光镜下观察肿瘤:400倍光镜下,对照组移植瘤细胞具有典型的恶性肿瘤细胞的形态特征,即细胞核大、深染,多个核仁,核异型性明显,病理性分裂相多见,肿瘤细胞数量多,排列紊乱,血窦丰富,癌巢呈团块状或条索状,癌组织中可见纤维结缔组织和血管增生,肿瘤的中央可见大量非坏死区域。给药组仍见肿瘤细胞的形态特征,即核大、深染,多个核仁,核异型性明显,病理性分裂相多见,但肿瘤坏死更加明显。3.5 免疫组织化学检测裸鼠瘤组织中LC3的表达免疫组化染色显示,LC3蛋白阳性表达产物主要位于细胞胞浆中,阳性表达信号均为棕黄。结果提示:在给予化香树果序醇提物灌胃治疗后,裸鼠瘤组织中LC3的阳性细胞数量增加明显,其中高浓度组中阳性相对高表达率为83.33%,对照组、中浓度药物组和低浓度药物组分别为16.67%、66.67%、33.33%,四组中LC3的表达具有显著性差异(X2=4.889,P=0.027)。第4部分化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌细胞自噬发生机制的初步研究化香树果序醇提物对自噬相关基因的影响:Real-time PCR结果显示,人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞经25mg/ml化香树果序醇提物处理24h后,与对照组相比,自噬相关基因mTOR和Akt1的表达水平有不同程度下调,BECN1和PTEN的表达水平有不同程度的上调。WesternBlot结果提示,与对照组相比,经药物处理后,细胞内Akt蛋白的表达水平明显降低,PTEN的表达水平上调。结论:一.采用醇回流法提取得到的化香树果序有效成分主要为黄酮或酚酸类,其出膏率约为4.0%;二.化香树果序醇提物在体外可诱导人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞发生自噬,从而抑制肿瘤细胞的生长,其自噬的程度与药物作用的时间和药物浓度呈正相关;三.化香树果序醇提物在体内也具有抗肿瘤活性,对人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制作用,其中以中浓度药物组(200g/kg组)的疗效最佳;四.化香树果序醇提物诱导人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞自噬的机制可能与阻断Akt/mTOR信号转导通路有关。