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酒精相关性肝病（Alcohol-associated liver disease,ALD）是指由于长期大量饮酒所导致的慢性肝脏疾病。ALD早期通常表现为酒精性脂肪肝,可进一步发展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化,甚至是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。临床上,ALD的早期症状并不典型,且缺乏有效的诊断指标。因此,寻找新的治疗靶点并研发新的药物是非常迫切和必要的。ALD的致病机制非常复杂,目前尚未完全阐明。在导致ALD发展的多种因素中,固有免疫细胞的激活发挥了关键作用。而且,肝脏组织的中性粒细胞浸润被认为是导致ALD发病和进展的中心事件。此外,研究表明驱动细胞衰老的因素也是促进ALD进展的关键因素。我们前期已经发现,衰老可以通过促进肝脏中性粒细胞浸润进而加重小鼠和人的酒精肝损伤。但是,ALD整个过程的炎症反应是非常复杂的,在不同诱因导致的ALD及ALD进展的不同阶段中,炎症免疫细胞均发挥着不同的作用,所以非常有必要深入研究其机制。Sirtuin1（SIRT1）,Sirtuin基因家族成员之一,是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性组蛋白去乙酰酶,主要在细胞核和细胞质中发挥作用。近年来,SIRT1在ALD疾病进展中发挥保护性的作用并可能成为ALD新的治疗靶点。虽然衰老导致的长寿基因SIRT1的下降可以增加ALD风险,但既往的研究机制多集中在参与肝损伤和肝纤维化的肝细胞和肝星状细胞上,而参与ALD炎症反应的中性粒细胞的SIRT1作用及潜在的机制并不清楚。尤为重要的是,在临床急性酒精中毒患者中,中性粒细胞是否也参与了ALD疾病的进展,SIRT1在人类ALD发生及进展过程的表达谱发生何种改变及其具体作用机制是什么等,都有待进一步阐明。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是一类非编码的单链RNA,可以通过与特定的mRNA结合来调控下游基因表达并发挥功能。近年来,越来越多的研究证实了miRNAs与ALD的发生与进展密切相关,这预示miRNAs可能成为有前景的ALD治疗的生物标志物。在机体衰老的过程中,多种中性粒细胞miRNAs的表达发生改变。中性粒细胞特异性的miRNAs改变对其功能的发挥起到关键的调节作用。所以,对中性粒细胞中miRNAs的进一步研究将有助于我们更好地理解衰老加重ALD的发病机制。本研究旨在检测衰老和饮酒对中性粒细胞SIRT1和microRNA-223（miR-223）的影响,以及它们对ALD发病机制的贡献。在实验中,我们对年轻小鼠和老年小鼠构建了Gao-binge模型（chronic-plus-binge ethanol feeding model,E10d+1B）,并分离、纯化骨髓（BM）和外周血/肝脏的中性粒细胞。通过PCR和Western blot（WB）方法,分析衰老对中性粒细胞Sirt1表达水平的影响。结果发现,老年小鼠BM和外周血中性粒细胞中的Sirt1 mRNA水平及BM中性粒细胞中的SIRT1蛋白水平均低于年轻小鼠。通过鉴定中性粒细胞中表达丰度高的micro-RNAs的差异性,结果发现,老年小鼠中性粒细胞特异性的miR-223和pri-miR-223含量均明显下调。E10d+1B喂养的小鼠肝脏中性粒细胞中Sirt1 mRNA的表达水平明显低于正常饮食喂养的小鼠（包括年轻小鼠和老年小鼠）,而酒精喂养后BM中性粒细胞中Sirt1 mRNA的表达仅仅呈下降趋势。有趣的是,酒精喂养后年轻小鼠的中性粒细胞miR-223水平迅速升高,而这种上调在老年小鼠中被钝化。衰老下调中性粒细胞Sirt1的表达引起了我们的重点关注并对其展开了功能学探究。通过Sirt1flox/flox小鼠与髓系细胞工具鼠（Lyz-cre）杂交几代后即可以得到髓系细胞特异性Sirt1基因敲除小鼠(Sirt1Mye-/-)和同窝对照(Sirt1f/f)小鼠,并建立E10d+1B模型。结果发现,敲除包括中性粒细胞在内的髓系细胞中Sirt1基因会加剧酒精诱导的肝损伤和炎症,提高肝脏脂肪变性和肝脏组织氧化应激,并降低中性粒细胞的miR-223的表达。这些结果提示,中性粒细胞SIRT1在ALD的发生和进展中起到保护作用。进一步地,我们对中性粒细胞Sirt1基因在ALD中发挥功能的具体机制进行探索。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验表明,SIRT1通过直接与控制miR-223生物发生的关键转录因子C/EBPα相互作用来促进C/EBPα去乙酰化,随后提高中性粒细胞中miR-223的表达。我们对健康对照人群的中性粒细胞SIRT1和miR-223进行了分析。结果发现:与年轻个体相比,中老年受试者中性粒细胞SIRT1和miR-223的表达是下降的。此外,中性粒细胞SIRT1/miR-223与循环中性粒细胞百分比呈负相关。值得注意的是,中性粒细胞SIRT1和miR-223之间存在正相关。此外,我们还分析了健康对照组和有慢性酒精饮酒史并因急性酒精中毒而到急诊科就诊的酒精中毒患者的中性粒细胞样本。结果显示,与健康对照组相比,酒精中毒患者的血清ALT、AST、循环中性粒细胞和血清miR-223升高,中性粒细胞SIRT1降低,这与上述E10d+1B喂养小鼠模型的结果一致。有趣的是,无论是健康组还是酒精中毒组,中性粒细胞miR-223水平在中年组都低于年轻组。此课题从动物水平、细胞水平和临床病人多个维度,系统地对中性粒细胞SIRT1功能及机制进行了探究。总而言之,研究发现衰老可以通过下调中性粒细胞SIRT1-C/EBPα-miR-223轴而增加小鼠和人类酒精性肝损伤的易感性,提示SIRT1可能是预防和/或治疗ALD的新治疗靶点。