背景神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种发生于中枢神经系统常见且严重的畸形,根据神经管发育缺陷的位置不同可以将其分为脑膨出、脑脊髓膜膨出、脊柱裂/隐形脊柱裂、唇裂及腭裂等。其病因复杂,遗传或孕妇生活的环境均在NTDs的发生中起着重要作用。在过去的二十年里,研究已表明母亲在孕期服用B族维生素叶酸可以预防许多神经管疾病。尽管这一发现可以说是出生缺陷研究中最重要的发现之一,但叶酸是如何发挥作用的以及具体的机制是什么目前仍不清楚。迄今为止的研究主要集中在以下假设上:神经管闭合时,潜在的遗传易感性与叶酸敏感的代谢过程相互作用,诱导了NTDs的发生。课题组前期的研究结果表明叶酸代谢通路中相关的一些关键酶代谢障碍,均可独立诱导NTDs的发生。腺苷激酶(adenosine kinase,ADK)可以催化腺苷转化为AMP,是嘌呤补救合成途径中的一个关键酶,也是叶酸实现其生物学功能的一个关键步骤。以往的研究表明嘌呤从头合成代谢障碍可以诱导NTDs的发生,但是嘌呤补救合成途径障碍是否可以导致NTDs的发生以及具体的分子机制是什么,目前尚不清楚。本研究旨在应用ADK的抑制剂5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)建立叶酸代谢障碍的动物模型,研究嘌呤补救合成中腺苷转化为AMP这一代谢途径障碍是否可以独立诱导NTDs的发生,为NTDs的研究提供新的动物模型,为进一步认识NTDs的分子机制提供帮助。目的:1.C57BL/6J小鼠注射ADK抑制剂ITU,制备NTDs动物模型。2.观察小鼠注射ADK抑制剂ITU后血浆中腺苷、AMP以及甲硫氨酸循环相关代谢物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)、S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine,SAM)的水平。3.初步探索神经上皮细胞的增殖、凋亡在NTDs发生中的作用及其具体机制。方法:1.C57BL/6J小鼠注射ADK抑制剂ITU,制备NTDs动物模型。将C57小鼠随机进行分组,分为对照组和ITU处理组,在小鼠妊娠7.5d,对照组腹腔注射含2%DMSO的生理盐水,ITU处理组分别注射不同剂量的ITU(2、3、4、5、6、7mg/kg),小鼠妊娠11.5d时取胚胎,将胚胎放置于体式显微镜下观察其发育情况。记录胚胎总个数、畸形个数、胚胎顶臀长和体重。2.小鼠胚胎脑组织切片进行HE染色,观察小鼠胚胎神经管发育情况。3.ELISA检测小鼠血浆中腺苷、AMP、SAH、SAM水平。4.检测由腺苷激酶抑制剂所引起的腺苷含量升高对小鼠胚胎脑组织RNA甲基化m6A的影响应用m6A甲基化检测试剂盒检测小鼠胚胎脑组织m6A的含量;采用Western Blot免疫印迹法检测小鼠胚胎脑组织中m6A相关酶蛋白METTL3、FTO、YTHDF2的表达。5.检测注射ITU后胚胎脑组织切片中神经上皮细胞增殖和凋亡的变化EdU、免疫组化检测组织切片中细胞增殖;TUNEL检测细胞凋亡;采用Western Blot免疫印迹法对胚胎脑组织中增殖和凋亡相关蛋白PCNA、Cleaved caspase-3的表达进行检测。6.观察ITU干预后海马神经元细胞HT-22细胞系增殖和凋亡的变化CCK8检测HT-22细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western Blot检测HT-22细胞中增殖和凋亡相关蛋白PCNA、Cleaved caspase-3的表达。结果:1.应用腺苷激酶抑制剂ITU成功建立了小鼠NTDs的动物模型,ITU剂量为5mg/kg时,小鼠NTDs的发生率最高(32.2%),此剂量作为最佳造模剂量。畸形以后脑畸形为主,部分胚胎表现为露脑畸形,其他畸形包括颅面部畸形、无眼畸形以及发育迟缓。NTDs组胚胎与对照组相比其顶臀长和体重均明显降低。2.胚胎脑组织切片经HE染色后显示:对照组胚胎脑组织发育状况较好,神经管管腔规整对称,神经上皮细胞紧密规则排列;NTDs组胚胎神经管管腔不规则,管壁厚薄不一,神经管未完全闭合,神经上皮细胞排列疏松、紊乱。3.ELISA检测小鼠注射ITU 0h、2h、4h、8h、12h后血浆中腺苷、AMP、SAH、SAM的含量,发现腺苷、SAM、SAH在注射2h后开始升高,8h达到高峰(与0h相比P<0.01),8h之后逐渐恢复到正常水平。而AMP的浓度在注射后2h开始降低,8h浓度达到最低(与0h相比P<0.01),8h之后逐渐恢复到正常水平。4.m6A甲基化检测试剂盒测定了对照组以及NTDs组小鼠胚胎脑组织总RNA中m6A的水平,发现NTDs组胚胎脑组织中m6A在总RNA中占的比例相对于对照组出现了明显的下降(P<0.01)。采用Western Blot法对小鼠胚胎脑组织中m6A相关蛋白的表达进行了检测,结果显示NTDs胚胎中METTL3的表达比对照组低(P<0.001),而FTO和YTHDF2的表达水平无明显变化(P>0.05)。5.EdU增殖检测结果表明NTDs胚胎脑组织中处于增殖期的细胞明显减少(P<0.05),细胞增殖减慢。免疫组化检测结果显示,NTDs组与对照组相比,胚胎脑组织切片中磷酸化组蛋白H3(Phospho-Histone H3,PH3)表达明显减少(P<0.05)。Western Blot法对增殖相关蛋白PCNA的表达量进行了检测,结果显示NTDs组比对照组表达量少(P<0.01);TUNEL凋亡检测结果表明NTDs组胚胎脑组织中凋亡细胞明显增多(P<0.05)。胚胎脑组织中凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的Western Blot法检测结果表明,NTDs组表达水平明显增加(P<0.05)。在NTDs胚胎脑组织中存在增殖与凋亡的紊乱。6.CCK8增殖检测结果表明,对照组、ITU浓度为1μmol/L和2μmol/L时,HT-22细胞的抑制率逐渐增加。流式细胞术凋亡检测结果表明,随着ITU浓度增加,HT-22细胞早、晚期凋亡率以及总凋亡率都增加。Western Blot检测结果显示,ITU浓度为1μmol/L和2μmol/L时HT-22细胞中PCNA的表达量比对照组减低(P<0.05,P<0.001),凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达量比对照组增加(P<0.01,P<0.001)。结论:1.应用腺苷激酶的抑制剂ITU成功建立了小鼠NTDs的动物模型,证实嘌呤补救合成途径中腺苷转化为AMP这一过程代谢障碍与NTDs的发生有密切联系。2.研究表明应用腺苷激酶抑制剂ITU所引起的腺苷含量升高会干扰甲硫氨酸循环,抑制SAM的转甲基反应,从而引起小鼠胚胎脑组织RNA甲基化m6A的减低。ITU会抑制AMP的生成,导致合成核酸的原料AMP的含量下降,抑制嘌呤的补救合成。3.ITU所引起的AMP含量下降以及RNA甲基化m6A的减低,会引起神经上皮细胞增殖和凋亡的紊乱,可能是ITU诱导NTDs的分子机制。