前言抗维生素D佝偻病(vitamin D resistant rickets)是一种以低磷酸盐血症导致骨发育障碍为特征的遗传性骨病。遗传方式多属X连锁显性遗传，偶为常染色体显性或隐性遗传，亦有部分病例呈散发，并无家族史。它与一般佝偻病不同，其发病原因是由于肾小管对磷的再吸收障碍，从而血磷下降，尿磷增多，肠道对磷，钙的吸收不良而影响骨质钙化，形成佝偻病。治疗这种佝偻病时，采用普通剂量的维生素D和晒太阳均难以收效，必须联合使用大剂量维生素D和磷酸盐才能起治疗效果，所以通常称为抗维生素D佝偻病。抗维生素D佝偻病发病率约为1：20，000。本病多发生于儿童，主要表现为生长发育迟缓，身材矮小，双下肢弯曲畸形，下肢疼痛，行走无力，骨质疏松或多发性骨折，牙釉质发育不良。在成人主要表现为软骨病和骨关节畸形。患者智力正常。尽管可以通过手术的方式予以改善症状，但手术治疗会给患儿家庭带来沉重的经济负担，疗效也因人而异，严重影响患者的生活质量。所以，只有明确其基因突变特点，才能从遗传筛查和基因诊断及治疗入手，避免患儿出生，纠正遗传缺陷，最终从根本上解决问题。抗维生素D佝偻病的基因按其功能命名，称为PHEX基因(磷酸盐调节基因)。PHEX cDNA全长已经被克隆，包含2247bp跨22个外显子的编码区，编码一条749个氨基酸的蛋白质。PHEX和中性肽链内切酶基因家族有高度的同源性，其家族包括中性肽链内切酶，Kell抗原，及内皮素转换酶1(ECE-1)等。PHEX基因突变是导致此疾病的主要原因。国外学者多用SSCP方法对PHEX基因突变进行了大量的研究，发现了一系列PHEX基因的突变，国内对此病的基因诊断研究还未见报导。我们应用DGGE方法对家族性及非家族性(散发)抗维生素D佝偻病患者进行PHEX基因突变分析。并且对PHEX基因内5个未报导过的STR位点进行了多态性分析，探索简易、快速并易于推广的抗维生素D佝偻病基因诊断方法。材料与方法一、研究对象10例抗维生素D佝偻病患者的静脉抗凝血，标本由中国医科大学第二临床医院儿科提供。所有患者均具有典型的临床表现。100例正常女性DNA，研究对象均来自中国东北地区正常汉族人群。二、实验方法1、应用常规饱和酚—氯仿法提取基因组DNA。2、PCR-DGGE方法检测PHEX基因突变(1)PCR扩增(2)DGGE检测(3)确定突变位点：和正常电泳带相比发生泳动变位的扩增产物重复两次后进行DNA测序以确定序列改变的位置与性质，并对100例正常人DNA的相同位点进行筛查，以排除该碱基置换是多态的可能性。3、STR位点多态性分析(1)PCR扩增(2)银染法(3)等位基因分型标准物的制备(4)数据分析实验结果一、PCR-DGGE检测结果经DGGE筛查并测序发现一名患者(H11)16外显子上游46bp(即15内含子)处存在T→C的单碱基置换，经过对100名正常人的同一位点进行筛查，没有发现相同的改变，可以排除多态，经P-match软件预测可能产生新的En-1(转录因子，调节肢体发育)结合位点，但具体作用是未知的，需要进一步的研究。另一家系先证者(H1)及其母亲(H2)在18外显子存在C→T的单碱基置换(CAG-TAG)，翻译产生的蛋白质621位的谷氨酰胺突变为终止密码子，产生截短的蛋白质，先证者为突变型半合子，其母亲为杂合型突变，确证了X-连锁显性遗传。二、STR多态性分析研究发现PHEX基因12内含子内的AAC重复序列，TTG重复序列，15内含子的TG重复序列及基因3’端的GT重复序列杂合度很低，不能作为基因诊断的DNA遗传标记。16内含子内的TTTA重复序列检测到5个等位片段，等位基因频率范围为0.03-0.39，基因型为11种，杂合度为69.3％，多态信息含量0.69，可以作为连锁分析的遗传标记。结论1、应用PCR-DGGE方法对PHEX基因的22个外显子进行突变研究，首次检测出PHEX基因两种新的突变类型。2、对PHEX基因内的5个STR位点进行多态性分析，发现16内含子的TTTA重复序列的杂合度和多态信息含量比较高，可以作为连锁分析的遗传标记。