第一部分VEGF及其受体在未成熟脑癫痫发生过程中的动态变化目的:探讨未成熟脑惊厥持续状态(Status Convulsion,SC)后的癫痫形成过程中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)在大鼠海马区表达的动态变化,并探讨其表达的意义。方法:选用144只20日龄健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分为对照组和SC模型组,采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立SC模型。分别于造模后1天、3天、7天、14天、28天及56天处死大鼠。采用Q-PCR、Western-blot、ELISA等方法分别从mRNA和蛋白水平检测不同时点大鼠海马区VEGF及VEGFR2的表达情况;并通过免疫荧光观察VEGF及VEGFR2在海马区的定位分布。结果:(1)Q-PCR结果显示,未成熟脑SC后海马区VEGF与VEGFR2 mRNA的表达呈一致性变化。海马区VEGF mRNA的表达在SC后急性期各时间点上均高于正常对照组,SC后第1天即达到高峰并且持续高表达,且SC后1天、3天VEGF mRNA显著增加(P<0.05);在SC后7天开始降低,SC后14天表达最低,而SC后28天又有复升的趋势。海马区VEGFR2 mRNA表达在SC后各时间点均较对照组升高,尤其是SC后3d和7d,差异具有统计学意义(p<0.01),SC后7天达到高峰;SC后潜伏期至慢性期过程中呈现逐渐降低趋势,SC后14天表达最低,SC后28天VEGFR2又有复升趋势。(2)Western-blot及ELISA结果显示,未成熟脑SC后海马区VEGF蛋白表达量从SC后1天起逐渐增高,7天达到高峰,且SC后1d、3d及7d较正常对照组显著增多(P<0.05)。VEGFR2蛋白在未成熟脑SC后表达升高,SC后3天达到高峰,较正常对照组显著增多(P<0.01);而后逐渐降低,SC后14天最低;在SC后28天至56天又有复升趋势。Q-PCR、Western-blot、ELISA的结果表明,SC后海马区VEGF及VEGFR2 mRNA与蛋白具有一致的表达趋势。(3)免疫荧光显示,在正常情况下VEGF和VEGFR2主要表达于海马齿状回(dentate gyrus,DG)门区,SC后在齿状回颗粒下层(subgranular zone,SGZ)、甚至齿状回分子层(molecular layer of DG,MoDG)以及CA1和CA3锥体细胞层均有表达。结论:在未成熟脑SC后不同时期海马区VEGF及VEGFR2表达具有波动性,呈现急性期上调、潜伏期逐渐下降而慢性期又有复升趋势,推测可能参与癫痫的发生发展。尤其是可能参与调节SC后海马齿状回神经干细胞的增殖反应以及对海马区锥体神经元在SC后的行为起到了一定的作用。第二部分VEGF对未成熟脑惊厥持续状态后海马神经干细胞的影响目的:探讨VEGF对未成熟脑惊厥性脑损伤后急性期海马神经干细胞(Neural stem cell,NSCs)增殖的影响。方法:选择20日龄的雄性SD大鼠在SC诱发前通过侧脑室注射PBS(SP)、不同剂量的VEGF(SV2:20ng/只;SV4:40ng/只;SV6:60ng/只)以及VEGFR2抑制剂SU5416(SU),从而调控VEGF的表达。侧脑室注射后12h,采用Licl-pilo建立SC模型。于SC后2h开始腹腔注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine,Brd U),每隔8h一次,注射6次,最后一次注射完毕后24h处死动物;采用免疫荧光检测海马DG区Ki67、Brd U/Dcx阳性的细胞数变化,确定SC后急性期VEGF对NSCs的增殖作用;通过尼氏染色观察SC后海马区神经元的损伤,观察VEGF是否可以抑制惊厥性脑损伤引起的海马神经元丢失。结果:(1)正常未成熟脑海SGZ区可见少量Ki67、Brdu/Dcx阳性细胞的表达。SC组Ki67、Brdu/Dcx阳性细胞数较正常对照组明显增高(P<0.05)。SC与SP组的Brdu/Dcx阳性细胞数差异不明显,分布区域亦相似。与SP组相比,不同剂量VEGF预处理干预组海马区Ki67和Brdu/Dcx阳性细胞数均明显增多(P<0.01),且呈一定的剂量依赖关系;分布区域较SP组更广,不仅仅局限在SGZ,在Mo DG区、齿状回多形层(Polymorphic layer of DG,Po DG)也有分布。SU5416干预组与SP组相比,Ki67、Brdu/Dcx阳性细胞数均明显减少(p<0.05)。(2)尼氏染色可见SC后海马结构严重破坏,CA1和CA3神经元丢失明显,尼氏小体明显减少,存在散在的核溶解。促进VEGF表达,SC后海马区结构损伤减轻,CA1和CA3区神经元丢失减少,排列紧密,细胞形态正常,细胞核和尼氏小体清晰可见,与正常对照组相比差异不明显。抑制VEGF表达后,SC后海马结构破坏严重,与SC组海马结构形态相似。结论:VEGF可促进未成熟脑SC急性期海马NSCs增殖,减少SC所致的海马CA1区和CA3区神经元丢失,改善未成熟脑SC后海马的病理损伤,对神经元有直接的保护作用。第三部分SC后不同时期调控VEGF对未成熟脑内神经再生及血管再生的影响目的:观察VEGF在未成熟脑SC后癫痫形成过程中对神经再生和微血管再生的作用,探索SC后不同时期调控VEGF的表达,对海马NSCs和微血管的影响及其可能的分子机制。方法:第一部分:选择20日龄的雄性SD大鼠随机分为对照组、SC模型组,采用Licl-pilo建立SC模型,于SC后7d、14d、28d处死取海马组织。采用免疫荧光和免疫组化检测Dcx和CD31蛋白,分析神经再生与血管再生在SC后变化。采用免疫双标CD31/PSA-NACM检测新生血管与NSCs的空间关系。第二部分:选择18日龄的雄性SD大鼠随机分为SC后急性期VEGF干预组(SV0)、SC后急性期SU5416干预组(SU0)、SC后潜伏期VEGF干预组(SV5)及SC后潜伏期SU5416干预组(SU5)。于生后18d,侧脑室埋管,在生后21d以Liclpilo方法诱导SC,造模成功后,分别从SC后2h或者5d连续3d通过侧脑室导管以0.5ul/min速度持续给予VEGF 40ng/d或SU5416 5m M/d。在SC后7d通过免疫荧光检测海马区Dcx表达,SC后28d通过免疫组化检测海马区CD31。并于持续给药后Western-blot检测VEGF下游VEGFR2、AKT、P-akt、ERK、P-erk蛋白的表达情况。结果:(1)正常对照组大鼠海马区Dcx阳性细胞几乎全部分布于海马SGZ区,在未成熟脑发育过程中,Dcx荧光强度表现出随着年龄逐渐降低的趋势。SC组Dcx的荧光强度各时间点与其对照组相比均增高,且SC后7天Dcx荧光强度差异具有统计学意义(P<0.01)。SC后7天Dcx阳性细胞在齿状回颗粒细胞层(granular cell layer,GCL)有分布,并表现出穿越GCL向Po DG迁移的趋势。(2)急性期促进VEGF表达可以增加Dcx的表达(P<0.01),分布部位仍主要是SGZ区及GCL区。潜伏期促进VEGF表达,并没有显著增加海马区Dcx的表达,然而Dcx阳性细胞的分布却不仅局限于SGZ区或者GCL区,在Po DG或者Mo DG均散在分布较多Dcx阳性细胞。在急性期或者潜伏期抑制VEGF的表达,将明显减少SC后海马区Dcx的表达(P<0.01),分布部位主要是SGZ区。(3)正常对照组海马区CD31表达与年龄的相关性不明显,SC后海马DG区的CD31的表达从SC后7天到28天逐渐增多,与正常同龄对照组相比,SC组各时间点微血管密度均明显增高(P<0.01)。(4)SC后急性期促进或者抑制VEGF表达,海马区CD31的表达和微血管密度较SC组都没有明显差异。但是SC后潜伏期促进VEGF表达,可以明显促进SC后慢性期海马区CD31表达和增加微血管密度(P<0.01);SC后潜伏期抑制VEGF表达,可以显著减少SC慢性期海马区CD31表达(P<0.01)。(5)SC后海马DG区CD31/PSA-NACM伴行。(6)SC促进VEGFR2下游P-akt、P-erk的表达。SC后急性期和潜伏期促进VEGF表达,均能一定程度增加海马区VEGFR2蛋白、VEGFR2下游的P-akt蛋白以及P-erk蛋白的表达;SC急性期抑制VEGF表达,将减少VEGFR2(P<0.01)蛋白、P-erk蛋白(P<0.01)的表达;SC潜伏期抑制VEGF表达,将降低P-erk蛋白的表达(P<0.01)和P-akt蛋白的表达(P<0.05)。结论:SC后海马神经再生与微血管再生密切相关,海马DG区NSCs沿着新生血管做链式迁移;在SC后不同时期干预VEGF信号通路,对海马区神经再生和血管再生影响不同;在SC后神经再生与血管再生的分子机制可能是通过EKR和AKT信号通路共同调节。第四部分时相性调控VEGF表达对未成熟脑SC后癫痫发作及惊厥易感性的影响目的:观察未成熟脑SC后不同时期干预VEGF对癫痫发作、惊厥易感性影响,探讨其在癫痫发生过程中的治疗时机。方法:选择18日龄的雄性SD大鼠随机分为正常对照组(Control)、模型组(SC)、SC后急性期VEGF干预组(SV0)、SC后急性期SU5416干预组(SU0)、SC后潜伏期VEGF干预组(SV5)及SC后潜伏期SU5416干预组(SU5)。建模和干预方法同第三部分。采用体视学检测SC后慢性期海马体积的变化,电镜检测SC后慢性期海马内突触的超微结构变化以尼氏染色观察海马形态学的变化。脑电图记录在SC后10天开始,每天记录2小时,连续记录14天,观察大鼠自发性痫性发作特征。并在SC后慢性期结合在体惊厥再燃实验和体外无镁诱导脑片自发放电模型,检测惊厥易感性的变化。结果:(1)SC后癫痫形成伴随着海马的体积变小、突触超微结构破坏、海马形态结构改变等病理损伤;而在SC后急性期促进VEGF的表达,可以减少SC后慢性期海马神经元的丢失、尼式小体的缺失;SC后潜伏期抑制VEGF表达,可以有效减轻SC后慢性期海马体积的缩小(P<0.01)、减短SC后突触前膜活性带长度的增加(P<0.05)、减轻SC后突触间隙宽度的增大(P<0.05),减轻SC后海马结构的病理损伤。(2)SC后潜伏期抑制VEGF表达可以有效减轻SRS期痫性放电的严重程度,与SC组相比,SU5组发作频率下降(p<0.05),发作持续时间缩短(p<0.01),发作次数减少(p<0.05)。(3)SC后潜伏期抑制VEGF表达,可延长大鼠惊厥潜伏期(P<0.01)和脑片放电潜伏期(P<0.05),降低惊厥易感性。结论:SC后潜伏期是影响癫痫形成的关键时期,在急性期促进VEGF的表达,潜伏期抑制VEGF的表达可以改善海马病理损伤,阻碍癫痫的形成。