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血吸虫病是一种严重危害人类健康的传染性疾病,是发展中国家的主要寄生虫病之一。我国长江中下游及两湖地区仍有不少人群受到血吸虫病的危害,因此,血防工作所面临的形势仍然十分严峻。血吸虫病的诊断是血吸虫病防治的中心环节,涉及治疗及预后。我国长期以来是将病原学检查即从粪便中查出虫卵或孵化出毛蚴作为血吸虫病诊断的金标准,并用以确定流行率,但随着控制血吸虫病策略的实施,经反复化疗,流行区病人的感染率和感染度明显下降,单纯依靠粪检不能满足血吸虫病诊断的需要,因此免疫学诊断方法已成为血吸虫病诊断的重要手段。我国学者从50年代开始致力于免疫诊断方法的研究,当前免疫学诊断主要是循环抗体和循环抗原的检测。检测循环抗体的敏感性和特异性虽较好,但难以区分现症感染和既往感染,也无法考核疗效,不利于血吸虫病的监测。循环抗原的检测可评估虫荷数和活动性感染,具有较好的疗效考核价值,同时还可作为现症感染的依据。但目前循环抗原的检测存在着敏感性低、特异性不理想等问题。因此,如何提高循环抗原检测的敏感性、特异性成为近年来研究的热点。 鸡卵黄免疫球蛋白(Eggyolk immunoglobulin,IgY)是鸡血液中的IgG被选择性转移到卵黄中形成的,而且是卵黄中的惟一免疫球蛋白类。IgY的结构与IgG相似,但在免疫诊断方面比哺乳动物源性的IgG更具优势:(1)由于种系之间发生距离大,母鸡可对哺乳动物产生更强的免疫应答。(2)母鸡可以持续地产生高亲和力的抗体。较少的抗原量就可以从免疫母鸡的卵黄中得到长效的高滴度IgY抗体。(3)无创性地收集抗体。(4)可快速简单地分离IgY。(5)IgY不能结合类风湿因子,可避免IgG因结合类风湿因子而造成的假阳性。(6)IgY不激活哺乳动物的补体。哺乳动物的IgG可激活补体,导致假阳性的产生。IgY不和补体发生反应,在检测哺乳动物的血清时,可减少由补体造成的干扰。 由于IgY抗体能提高免疫检测的敏感性、特异性,还具有产量大、性质稳定等优点,近年来,IgY在疾病的诊断方面得到了广泛的应用。本研究拟制备抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Soluble egg antigen,SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),并用基于IgY的双抗体夹心ELISA来检测血吸虫病人血清中的循环抗原。 本研究首先制备和鉴定了抗日本血吸虫SEA的IgY。日本血吸虫SEA经皮下免疫25周龄的莱杭母鸡4次,免疫剂量为100μgSEA/只,免疫间隔10天,于末次免疫后一个月加强免疫一次。用EGGstract IgY Purification System提纯IgY,BCA法测定其蛋白含量,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)分析。结果发现,每枚鸡蛋经EGGstract IgY Purification System提纯后可得到约69mg抗体。经SDS-PAGE分析,EGGstract IgY Purification System提纯的完整的IgY有一条主要蛋白带,相对分子质量(Mr)为130000;裂解后的IgY包含66000和35000的两条带和其它五条带。 应用间接ELISA法检测免疫后30d-60d的IgY抗体的特异性。每孔SEA200ng/ml包被4℃过夜,次日pH7.4 PBS-Tween20(0.05％)洗涤3次、甩干,加10%BSA100μl/孔37℃封闭2h,洗涤、甩干。每孔加1:80稀释的免疫后不同时间的IgY100μl,37℃温育1h;洗涤后加入辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的兔抗鸡IgY(工作浓度为1:1000)100μl,37℃温育1h;加四甲基联苯胺(Tetramethyl benzidine,TMB)37℃显色15min,2mol/L硫酸终止反应,在酶标仪上读取吸光度(A450值),并计算S/N值。结果表明,免疫后30d-35d的IgY作ELISA检测时S/N值最高,直到第60d,结果仍为阳性,表明免疫后30-60d的IgY均可用于抗原的检测。 应用基于IgY(30d-35d)抗体的双抗体夹心ELISA法检测了15例日本血吸虫病人血清,同时做交叉反应,检测了10例肝吸虫病人血清及10例肺吸虫病人血清。以15μg/ml的IgY作为捕获抗体,包被96孔酶标板,4℃过夜,pH7.4 PBS-Tween20(0.05%)洗涤3次、甩干,加5%BSA200μl/孔37℃封闭1h,洗涤、甩干后,每孔加200μl的病人血清和正常人血清,37℃温育1h,洗涤、甩干后,以抗日本血吸虫SEA的单克隆抗体NP28-5B为检测抗体,200μl/孔37℃温育1h,洗涤3次甩干,再加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(工作浓度为1:5000),37℃温育1h,同法洗涤、甩干,加底物TMB37℃显色15min,2mol/L硫酸终止反应,在酶标仪上读取吸光度(A450值)。结果判定:测定孔A值/阴性对照孔A值(S/N)大于2.1判为阳性。结果表明,慢性血吸虫病人的检出率为53.3%,与肝吸虫和肺吸虫无交叉反应。 本研究制备了抗日本血吸虫SEA的特异性抗体IgY,动态观察了免疫后30d-60d的IgY的特异性变化,其S/N值均大于2.1,表明在30d-60d这段时间的IgY都可用来检测SEA。我们用IgY的双抗体夹心ELISA法检测日本血吸虫病人血清中的循环抗原并做了交叉反应,说明IgY在日本血吸虫循环抗原的检测方面具有较好的应用前景。