【摘 要】
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目的:肾母细胞瘤是小儿外科临床上发病率最高的恶性肿瘤,占儿童肾肿瘤的90%,高危患者无事件生存率仍然较低,且治疗晚期效应风险增加。但肾母细胞瘤形成的分子机制不明,相关易感基因已报道40余种。癌细胞的其中一个标志是表观基因沉默。DNA甲基化和组蛋白修饰是两种目前研究较重要的表观遗传变化。组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）是组蛋白去乙酰酶（histone deacetylase,HDACs）家族中Ⅱα类
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目的:肾母细胞瘤是小儿外科临床上发病率最高的恶性肿瘤,占儿童肾肿瘤的90%,高危患者无事件生存率仍然较低,且治疗晚期效应风险增加。但肾母细胞瘤形成的分子机制不明,相关易感基因已报道40余种。癌细胞的其中一个标志是表观基因沉默。DNA甲基化和组蛋白修饰是两种目前研究较重要的表观遗传变化。组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）是组蛋白去乙酰酶（histone deacetylase,HDACs）家族中Ⅱα类酶,参与转录调控、增殖、凋亡和细胞周期等关键细胞过程,因其在肿瘤发生中的表观遗传学作用而成为潜在的治疗靶点。临床前研究已经证明了 HDAC抑制剂作为潜在抗癌药物的治疗应用。因此研究HDACs在肾母细胞瘤中的生物学功能便具有重要的临床意义。本项目主要研究HDAC5在肾母细胞瘤中的表达情况,通过体外细胞实验研究HDAC5的差异表达对肿瘤细胞的活力和增殖的作用,并进一步探讨HDAC5在肾母细胞瘤中对c-Met调控作用及其分子机制。方法:收集23对在苏州大学附属儿童医院外科进行手术治疗的原始肾母细胞瘤组织和正常肾周组织行定量PCR测定HDAC5的mRNA表达量,Western blot分析HDAC5的蛋白表达量。编码过表达HDAC5-Flag、靶向沉默HDAC5特异性小干扰RNA（siRNA）的质粒分别转染肾母细胞瘤系G401细胞。定量PCR测定经转染后肾母细胞瘤系G401细胞中的HDAC5表达,CCK-8和BrdU掺入分析测定经转染肾母细胞瘤系G401细胞增殖活力,Western blot分析HDAC5的蛋白表达量。在过表达HDAC5和靶向沉默HDAC5的肾母细胞瘤系G401细胞中进行c-Met定量PCR检测及Western blot蛋白分析。在过表达HDAC5的G401细胞中转染特异性针对c-Met的siRNA,进行c-Met定量PCR检测及Western blot蛋白分析,CCK-8和BrdU掺入分析测定经转染肾母细胞瘤系G401细胞增殖活力。结果:使用RT-qPCR检测证实肾母细胞瘤瘤体组织中HDAC5的mRNA表达较正常肾周非肿瘤组织显著增加（p＜0.05）,Western blot分析测定显示瘤体组织中HDAC5的蛋白表达较正常肾周非肿瘤组织增加。RT-qPCR和Western blot证实过表达HDAC5和靶向沉默HDAC5使靶基因分别相应上调和下调。CCK-8分析表明,HDAC5的过度表达明显促进了肾母细胞瘤系G401细胞的增殖,BrdU掺入法显示与对照组肾母细胞瘤系G401细胞相比,过表达HDAC5的肾母细胞瘤系G401细胞表现出更快的生长速度（p＜0.05）,靶向沉默HDAC5则降低了肾母细胞瘤系G401细胞的增殖率（p＜0.05）。与对照组肾母细胞瘤系G401细胞相比,过表达HDAC5的肾母细胞瘤系G401细胞的c-Met mRNA表达增加了 4倍以上（p＜0.05）,Western blot分析也证实了转染HDAC5的细胞中c-Met的上调。siRNA干扰下调HDAC5后,肾母细胞瘤系G401细胞中c-Met的表达降低（p＜0.05）。使用特定siRNA抑制c-Met的表达后,RT-qPCR检测及Western blot蛋白分析显示c-Met下降。CCK-8分析和BrdU掺入法显示c-Met的下调抑制了 HDAC5对肾母细胞瘤系G401细胞的促增殖作用。结论:本研究创新性的将表观遗传学组蛋白修饰中的组蛋白去乙酰酶HDAC5在肾母细胞瘤临床样本中表达情况进行研究,证实HDAC5显著增高。并尝试对HDAC5的作用机制进行探索,证实过表达HDAC5明显促进了肾母细胞瘤系G401细胞的增殖,靶向沉默HDAC5降低了肾母细胞瘤系G401细胞的增殖率。此外,本研究证实过表达HDAC5促进了 c-Met的表达,靶向沉默HDAC5使肾母细胞瘤系G401细胞中c-Met的表达降低。抑制c-Met的表达下调肾母细胞瘤细胞中HDAC5的促增殖作用。
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