目的:心力衰竭是由于心脏结构或功能的异常,损害了心脏的充盈或射血功能,致使心输出量不足的一种复杂的临床综合征。临床上,现有的治疗药物主要通过抑制神经内分泌系统激活（肾素血管紧张素醛固酮受体拮抗剂）,改善代谢（钠葡萄糖同向转运体拮抗剂）发挥作用。尽管如此,仍有部分心衰患者预后无法改善。故寻找新的治疗方法是临床亟待解决的问题。近年来,有研究发现Tregs/Th17平衡紊乱在心力衰竭的形成及进展过程中起着重要的作用。维持Tregs/Th17平衡,有利于机体维持免疫稳态,从而改善心肌重塑和心功能。因此,调节Tregs/Th17平衡可能是改善心衰患者预后的重要方向。m TOR是细胞新陈代谢和免疫功能之间的一个重要的连接,通过增加磷脂酰肌醇3-激酶-西罗莫司靶蛋白（PI3k/Akt/m TOR）这条通路中的m TOR活化作用,进而可以增加免疫细胞生成、中和Tregs分化。有研究推测PI3k/Akt/m TOR信号通路的激活和抑制均影响Foxp3+的表达,从而干预Tregs细胞活化,进而影响Tregs/Th17的免疫自稳状态的改变。但是到目前为止,慢性心衰时为何Tregs/Th17细胞平衡紊乱,以及调控Tregs/Th17细胞的分子机制仍知之甚少。因此,本课题研究拟围绕四个方面进行:（1）探讨慢性射血分数减低心衰患者外周血否存在Tregs/Th17失衡。（2）通过构建心衰犬模型,并进行全长转录组测序,探讨慢性心衰过程中与Tregs/Th17有关的潜在分子机制或靶点。（3）基于公共数据集对心梗后心衰大鼠转录分析,探讨心梗后心梗中与免疫相关的机制。（4）探讨调节PI3k/Akt/m TOR对心肌Tregs/Th17失衡和心室重塑的影响及其机制,为心衰的治疗提供新的思路和治疗靶点线索。方法:第一部分:收集我院2019年12月至2021年12月在心脏中心住院的慢性射血分数减低心衰患者80例,对照组60例,采用流式细胞分析法检测外周血中Tregs细胞、Th17细胞,提取患者入组时心脏超声检查和B型钠尿肽（BNP）数据。第二部分:将对照组（n=3）和心衰组（n=3）比格犬的心肌组织用于进行全长转录组测序,心衰模型采用快速右心室起搏的方法建立。术后采用超声心动图测量计算左心室射血分数（EF）、BNP判定造模成功。确定达到心衰指征后,将右室心肌组织进行全长转录组测序（基于纳米孔平台）,并对差异表达转录本和差异表达基因进行Gene Ontology（GO）和（KEGG）分析。使AStalavista工具进行可变剪接的分析,Animal TFDB 3.0软件预测转录因子,CNCI、CPC、CPAT、和Pfam数据库鉴定lnc RNA。最后,可变剪接,转录因子和lnc RNA的KEGG通路分析采用Enrichr4软件。此外,我们还通过定量实时PCR（q RT-PCR）评估了与Th 1、Th2、Th17相关的候选基因表达。第三部分:本研究从基因表达综合数据库GEO中检索心梗与心衰获得GSE47495（Affymetrix Rat Gene 1.0 ST Array）大鼠左心室基因表达数据,其中包含23例大鼠左心室样本,5例假手术和18例心衰模型。使用R语言limma包线性拟合方法、贝叶斯分析和t检验的算法识别心衰和假手术大鼠之间的差异表达基因（DEGs）。将P＜0.05的基因定义为差异表达基因。并将差异表达基因进行基因本体论（GO）及京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库分析,我们通过R包（GSVA、GSEABase和limma）进行ss GSEA分析,研究中的每个样本的免疫学特征和免疫功能与临床症状的相关性。并且筛选WGCNA基因并进行加权基因共表达网络的构建。选择与Tregs和Th 1、Th2、Th17显着相关的模块进行功能富集分析（GO/KEGG）,最后进行基因集富集分析（GSEA）与基因集变异分析（GSVA）以及通路核心基因与免疫细胞评分间的相关性分析。第四部分:24只健康雄性SD大鼠,随机分为对照组（n=6）、心衰组（n=6）、雷帕霉素组（雷帕霉素+心衰组,n=6）、甲氨蝶呤组（甲氨蝶呤+心衰组,n=6）,心梗后心衰模型建立采用冠脉左前降支结扎的方法构建,4周明确心衰后,甲氨蝶呤组和雷帕霉素组分别给予甲氨蝶呤、雷帕霉素连续给药4周。4周治疗结束后,采用超声心动图评价大鼠的心脏功能;ELISA法检测血清中BNP,IL-1β,IL-6,TNF-α;MASSON染色观察大鼠心肌组织的病理变化,TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况,流式细胞技术检Th17、Tregs细胞数量,PCR检测大鼠心肌组织中PI3k/Akt/m TOR信号通路表达情况。结果:第一部分:与正常对照组比较,射血分数减低的慢性心力衰竭患者Tregs的比例显著下降,Th 17细胞显著增加,Th 1明显增加,Th2明显减低,这种改变是慢性心力衰竭免疫激活的重要体现。第二部分:在快速起搏心衰模型构建术后4周,心衰组犬外周血血清BNP、IL-17均显著增加,射血分数较对照组显著降低。通过全长转录组测序共计鉴定了67458个转录本。从心衰组和对照组获得785个差异转录本（DETs）。其中,差异DETs富集于免疫应答,尤其以Th1、Th2和Th 17分化为主,并且富集了8个基因参与Th 1、Th2和Th 17细胞分化,其中,DLA-DMA,DLA-DQB1、DLA-DRA和HLA-DRB1基因表达上调,FOS、JAG2和JUN基因表达下调;从差异表达转录本及差异表达基因的分析中发现了众多信号通路的富集,比如TGF-β信号通路、MAPK、Ras、PI3k/Akt等信号通路。对心衰组相关肌节基因的可变剪接分析显示,五个基因（TTN、TNNI2、TNNI3、MYBPC3和FLNC）具有可变剪接事件。KEGG富集分析显示差异剪接基因丰富在醛固酮合成和分泌、线粒体自噬、肾上腺素能心肌细胞中的信号传导、肥厚型心肌病和扩张型心肌病。并且发现4892个转录因子和406个lnc RNA。具有可变剪接事件的转录因子参与了心肌纤维化、肥大、以及Tregs稳定性。第三部分:心梗后心衰大鼠转录组分析共鉴定到1498个差异基因,其中上调665个,下调883个。GO富集分析差异基因富集在线粒体基因表达,能量代谢,核糖核苷酸代谢过程等。差异基因KEGG富集到碳代谢,自噬,MAPK信号通路,PI3k/Akt信号通路,m TOR信号通路,Th 1、Th2和Th 17细胞分化。免疫浸润分析Th1,Th17有显著上升,而Th2、Tregs显著下降。重要模块的功能富集分析,基因集富集分析（GSEA）与基因集变异分析（GSVA）均发现与免疫及TGF-β信号通路,PI3k/Akt/m TOR信号通路有关。差异表达且调控Th 1、Th2和Th 17细胞分化的基因与ss GSEA免疫评分做相关性分析显示RUNX1,HLA-DMA,CD4对Th 1、Th2、Tregs有很高的正相关性,而RORC对Th1、Th2、Tregs具有很高的负相关性。其次RUNX1,HLA-DMA,CD4对Th17具有较高负相关性,RORC,PPP3CA,JAG2对Th17具有较高正相关性。第四部分:与对照组相比,心梗后心衰大鼠m TOR表达明显增加,Tregs明显减低,Th17明显增加。与心衰组相比,雷帕霉素和甲氨蝶呤抑制m TOR m RNA表达,而且与心衰组相比,雷帕霉素组心肌细胞凋亡、心肌纤维化明显减少,心功能明显改善,Tregs显著增加、Th 17显著减少。与心衰组相比,甲氨蝶呤组心肌凋亡明显减少,Tregs明显升高、Th17明显减低。结论:1.慢性射血分数减低心力衰竭患者的Th17细胞比例增加,Tregs细胞比例下降。2.全长转录组测序富集到与免疫相关的过程参与了Th1、Th2和Th17细胞分化。并且PI3k/Akt/m TOR信号通路、TGF-β信号通路、MAPK、Ras信号通路明显的富集。3.基于公共数据集的心梗后心衰大鼠转录组分析差异基因富集于Th1、Th2、Th17分化,以及PI3k/Akt/m TOR信号通路。4.心梗后心衰大鼠m TOR信号通路激活,雷帕霉素抑制m TOR信号通路,抑制心肌凋亡,心肌炎症、上调Tregs、下调Th17细胞,从而逆转心脏重塑,延缓心力衰竭进展,此外甲氨蝶呤通过抑制m TOR信号通路上调Tregs、下调Th17细胞。