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目的:研究高糖培养的肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)内氧化应激状态与锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,MnSOD)表达的关系及其可能的分子机制。
方法:本实验主要通过体外高糖培养大鼠MC进行研究。设立正常组(NS组)、甘露醇组(MA组)、高糖组(HG组)、溶媒对照组(DMSO组)、过氧化氢组(H2O2组)、TGF-β1抑制剂组(SB431542组)、过氧化氢与TGF-β1抑制剂共培养组(HS组)、抗氧化剂组(NAC组)、PI3K抑制剂组(LY-294,002组)。按需要,分别在培养16 h时检测以下各项指标:流式细胞仪检测细胞中ROS的水平(HG组检测4h、10h、16h、28h4个时间点);RT-PCR法测定TGF-β1 mRNA、MnSOD mRNA的相对含量;Western blot法测定细胞中Akt,p-Akt,FoxO3a,p-FoxO3a,MnSOD蛋白表达水平;可见光分光光度法测定胞浆T-SOD和MDA抗氧化指标的水平。
结果:所有结果均显示,NS组与MA组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);HG组与DMSO组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
1.对T-SOD及MDA含量的影响
与NS组比较,HG组表现出T-SOD含量减少(P＜0.01),MDA水平提高(P＜0.01),差异有统计学意义;与DMSO组比较,SB431542组、NAC组、LY-294,002组表现出T-SOD含量增加(P＜0.01),MDA水平下降(P＜0.01),差异有统计学意义。
2.ROS的变化
HG组检测4 h、10 h、16 h、28 h4个时间点时ROS的释放量,其他各组均只检测16 h时的结果。HG组与NS组比较,在4h、10 h、16 h、28 h4个时间点HG组ROS释放量均增加,差异有统计学意义(P＜0.01),且随时间的延长,ROS的生成量有增加的趋势;与DMSO组相比较,SB431542组、LY-294,002组及NAC组ROS的生成量均减少,且差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.TGF-β1 mRNA水平的变化
PCR结果显示,与NS组比较,HG组、H2O2组TGF-β1 mRNA水平有所提高,差异有统计学意义(P＜0.05);与DMSO组比较,SB431542组、NAC组TGF-β1 mRNA水平下降,差异有统计学意义(P＜0.05);与H2O2组比较,HS组TGF-β1 mRNA水平下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。
4.Akt蛋白磷酸化水平的变化
Western blot结果显示,各组间总Akt蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与NS组比较,HG组、H2O2组P-Akt/T-Akt值升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);与DMSO组比较,SB-431542组、NAC组p-Akt/T-Akt值降低,差异有统计学意义(P＜0.05);HS组结果与H2O2组比较,p-Akt/T-Akt值降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。
5.FoxO3a蛋白磷酸化水平的变化
Western blot结果显示,各组间总FoxO3a蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与NS组比较,HG组、H2O2组P-FoxO3a/T-FoxO3a值升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与DMSO组比较,SB431542组、NAC组、LY-294,002组P-FoxO3a/T-FoxO3a值均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);HS组结果与H2O2组比较,p-FoxO3a/T-FoxO3a值降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。
6.MnSOD表达的差异
与NS组比较,HG组和H2O2组MnSOD mRNA水平及其蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与DMSO组比较,SB431542组、NAC组、LY-294,002组MnSOD mRNA水平及蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与H2O2组比较,HS组MnSOD mRNA水平及蛋白表达升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
1.高糖诱导的氧化应激状态下,大鼠MC中ROS大量生成,超量生成的ROS可上调TGF-β1,并激活其下游PI3K/Akt/FoxO3a信号通路,最终负性调控MnSOD的表达。
2.高糖诱导的氧化应激状态下,大鼠MC中MnSOD表达的减少使细胞清除ROS的能力降低,从而促使ROS在大鼠MC中进一步大量生成。
3.高糖培养大鼠MC时,在氧化应激的诱导下可能存在以。TGF-β1为中心、MnSOD参与调节的ROS产生的恶性循环。