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刚毛柽柳（Tamarix hispida）是一种耐盐碱和干旱的盐生木本植物,研究其抗逆机制具有重要意义。基因调控网络可以清晰地阐述特定生物过程中不同基因间的关系与角色,且对鉴定关键调控基因来阐明该生物学过程分子机制具有指导意义。在本研究中,我们建立柽柳响应高盐、干旱胁迫的基因调控网络,并筛选出在耐盐、抗旱过程中同时起作用的关键调控基因。另外,我们基于柽柳高盐和干旱胁迫的转录组数据获得一个乙烯不敏感转录因子3-like（ethylene-insensitive 3-like,EIL）,命名为ThEIL1。在本研究中,以柽柳为试验材料,对ThEIL1的耐盐机制进行研究。用500 m M Na Cl和35%PEG6000分别对柽柳进行3、6、9、12和24 h胁迫处理,以水浇灌的柽柳作为对照。不同的处理在不同时间开始,使得所有处理及对照在同一时间取材,3个生物学重复,进行RNA-seq分析。根据转录组数据获得差异表达基因,利用“皮尔逊相关系数、偏相关系数与生物学过程相结合的算法”建立柽柳响应高盐、干旱胁迫的基因调控网络（Gene Regulatory Network,GRN）并鉴定。构建ThEIL1的过表达载体和抑制表达载体并分别瞬时转化柽柳,以及使用蘸花法将过表达载体ThEIL1稳定转化拟南芥并获得转基因株系。在盐胁迫下,以瞬时转化的柽柳和转基因拟南芥为试验材料,来研究ThEIL1的耐盐机制。（1）柽柳响应高盐、干旱胁迫的基因调控网络的获得。根据转录组数据将盐胁迫和干旱胁迫下差异表达的基因分成调节基因和被调节基因。采用自下而上的方式建立基因调控网络,首先将参与盐、旱胁迫相关生物过程的功能基因作为GRN底层,使用皮尔逊相关系数和偏相关系数预测调控这些功能基因的转录因子并作为GRN的第二层。再将获得的GRN第二层转录因子作为研究对象,使用皮尔逊相关系数和偏相关系数预测调控这些TFs的转录因子并作为GRN的第一层。即获得柽柳响应高盐、干旱胁迫的两个三层基因调控网络。（2）基因调控网络的验证和基因抗逆性分析。随机挑选并克隆出26个GRN中的转录因子,即响应Na Cl胁迫GRN第一层有5个转录因子、第二层6个转录因子、响应PEG胁迫GRN第一层5个转录因子和第二层10个转录因子,分别构建到含有Flag标签的p CM1307载体上并瞬时转化柽柳作为试验材料,用ChIP-PCR和q RT-PCR对转录因子与预测的靶基因间的调控关系进行鉴定。ChIP-PCR和q RT-PCR结果表明,转录因子与其预测的下游靶基因之间的调控关系为直接调控、间接调控和非调控关系;对调控和非调控关系进行统计,有75.58%以上的调控被证明为直接调控和间接调控,以上结果说明基因调控网络真实、可靠。此外,从这26个转录因子中随机挑选20个基因瞬时转化柽柳并测定抗逆相关生理指标,进行抗逆性分析。为进一步研究GRN中转录因子的耐盐、抗旱性,随机将其中8个转录因子稳定转化拟南芥,对其耐盐、抗旱功能进行研究。以上结果表明过表达这些转录因子显著提高了植株的抗性。（3）利用酵母单杂交技术调取能够同时调控Na Cl胁迫GRN顶层转录因子和PEG胁迫GRN顶层转录因子的TFs。分别从Na Cl胁迫GRN顶层和PEG胁迫GRN顶层各随机挑选一个转录因子,且将这两个转录因子的启动子分别构建到p HIS2载体上,与柽柳c DNA文库共转Y187。经过两次酵母单杂交后,获得的酵母菌提取质粒并送公司测序,进而获得大量能够同时调控Na Cl胁迫GRN顶层转录因子和PEG胁迫GRN顶层转录因子的TFs,从这些TFs中选择富集数较高的三个转录因子,进行ChIP-PCR验证。结果表明,这三个转录因子可以同时调控Na Cl胁迫GRN顶层转录因子和PEG胁迫GRN顶层转录因子。（4）柽柳ThEIL1的功能和耐盐机制的研究。首先对ThEIL1蛋白进行多序列比对和进化树分析,结果表明ThEIL1具有EIN3保守结构域、N端氨基酸序列高度保守;亚细胞定位结果说明其蛋白定位于细胞核;利用酵母双杂交的方法研究ThEIL1是否有自激活活性,结果证实,ThEIL1具有转录激活活性且自激活区域在基因的末端。在盐胁迫下,对过表达ThEIL1和抑制表达ThEIL1瞬时转化的柽柳和过表达ThEIL1转基因拟南芥的抗逆性研究结果表明,过表达ThEIL1显著提高了植株的耐盐性。使用酵母单杂交和EMSA对ThEIL1结合的顺式作用元件进行研究,结果表明ThEIL1特异性识别PERE和GCC-box,而不与其突变体结合。以上结果表明,我们成功地构建并验证了柽柳响应高盐、干旱胁迫的GRN,且鉴定了调控耐盐、抗旱的关键基因,并使用酵母单杂技术调取能够同时调控Na Cl胁迫GRN顶层转录因子和PEG胁迫GRN顶层转录因子的TFs。ThEIL1特异性识别PERE和GCC-box来激活下游靶基因的表达,瞬时过表达ThEIL1使植株的细胞膜损伤程度减小、ROS含量下降,SOD和POD活性、脯氨酸含量和海藻糖含量升高,从而提高植株的耐盐性,而ThEIL1抑制表达的柽柳抗逆性明显降低;将该基因过表达稳定转化拟南芥时,其耐盐能力明显提高,进而明确了柽柳ThEIL1的耐盐机制。