第一部分天麻对神经干细胞的影响天麻(Gastrodia elata)是可以用于保健食品的药材,在我国被广泛的栽培与使用。我国现代医学研究表明,天麻含酚类、多糖类、甾醇类和有机酸类等多种活性成分,因而具有抗惊厥、镇痛、降压、保护神经细胞、延缓衰老、增强免疫、抗氧化等作用。本文通过免疫细胞化学研究,发现采用天麻预先处理小鼠神经干细胞能够缓解细胞因Co Cl2缺氧而导致的细胞增殖能力的下降。神经细胞长时间的缺氧会引起神经细胞的凋亡、结构发生改变和神经系统的功能减退,进一步可能引起癫痫、阿尔茨海默症以及帕金森等多种神经性疾病。本研究结果表明:长期适量的服用天麻能够起到降低患阿尔兹海默症和帕金森等退行性神经疾病的可能性。为了进一步研究天麻对神经干细胞作用的分子机制,我们采用RNA-Seq高通量测序技术分析了天麻作用前后神经干细胞的表达谱,并通过WGCNA方法获得了基因共表达网络。在对胚胎神经干细胞的研究中,共获得26个共表达模块,它们都与天麻呈现一定的正负相关性。我们选取了其中4个模块进行了KEGG功能富集分析,在与天麻显著正相关模块salmon2中发现了包括错配碱基修复(Mismatch repair)、同源重组(Homologous recombination)、核酸切除修复(Nucleotide excision repair)、碱基切除修复(Base excision repair)以及非同源末端连接(Non-homologous end-joining)在内的多个与DNA损伤修复相关的通路,表明天麻能够激活DNA损伤修复相关基因的表达。而与天麻显著负相关的模块green中发现了凋亡Apoptosis通路。除此之外,根据模块分析,天麻也和DNA的复制(DNA replication)、细胞周期(Cell cycle)、蛋白质的生物合成(Ribosome biogenesis in eukaryotes,Aminoacyl-t RNA biosynthesis)、碱基的生物合成(Pyrimidine metabolism和Purine metabolism)等与细胞增殖相关的通路呈正相关;和几个疾病相关的通路,如Parkinson’s disease、Alzheimer’s disease、Huntington’s disease呈负相关。这些结果表明:细胞在缺氧的逆境中DNA损伤严重,这种损伤如果不能得到修复就会引起细胞的凋亡,加入天麻后细胞之所以能够缓解因Co Cl2缺氧而导致的细胞增殖能力的下降,其根本原因就在于DNA损伤修复能力加强,凋亡细胞减少。生物信息学分析显示:天麻正相关salmon2模块中存在与DNA修复以及周期相关的基因,如POLD1基因、MCM5基因和ANAPC5基因。POLD1基因编码DNA聚合酶δ的C末端亚基,具3’-5’外切酶活性,是DNA复制和修复过程中起关键作用基因;MCM5基因编码的蛋白是与DNA复制有密切关系的蛋白,该蛋白只在处于增殖活动周期的细胞内表达,决定细胞由G0期向G1/S期转变,是增殖细胞的特殊标志物;ANAPC5基因产物参与控制细胞有丝分裂和细胞周期G1期的进程。天麻负相关green模块中存在细胞凋亡中非常重要的基因——TNFRSF10B和MAPKAPK3。TNFRSF10B基因编码的蛋白定位于细胞膜,招募FADD、CASP8等形成死亡诱导信号复合体(DISC),启动CASP级联反应,诱导细胞凋亡。而MAPKAPK3基因产物是MAPK信号通路蛋白,而该信号通路参与细胞增殖和凋亡的调节。本研究从细胞水平和分子水平阐明了天麻通过激活神经干细胞的DNA损伤修复相关基因的表达,从而抑制细胞凋亡的机制。研究结果为天麻作为保健食品的研究、开发及生产提供理论依据。第二部分小分子RNA对神经干细胞增殖分化的影响——micro RNAs抑制脆性X综合征基因FMR1的表达及调节小鼠胚胎神经干细胞的增殖和分化最常见的遗传性智力低下疾病——脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是由于存在于X-连锁的脆性X智力低下基因1(Fragile X mental retardation 1,FMR1)的5′非翻译区域(5′untranslated region,5′-UTR)的CGG三核苷酸重复产生了异常扩增,而最终导致脆性X智力低下蛋白(Fragile X Mental Retardation Protein,FMRP)表达的转录沉默或减少。在人群中,CGG三核苷酸重复具有高度的多态性,正常人的重复数介于6-54之间,并可以在子代稳定的遗传;当重复数扩展至55-200之间时,被称为“前突变”,“前突变”极其不稳定,可以在母婴传播过程中演变成全突变;当重复数超过200时,被称为全突变,全突变患者在CGG三核苷酸重复、Cp G岛以及邻近的基因序列上发生过度甲基化,导致FMR1基因转录沉默,不能翻译产生FMRP。FMRP是一种在进化上保守的选择性的RNA结合蛋白。在脑组织中,FMRP可选择性的与含自身m RNA在内的超过4%的信使RNA结合,从而抑制它们的表达。FMRP在哺乳动物的脑、血液、睾丸、脾和肝组织中都有分布,尤其在神经元细胞中高表达。多项研究表明,FMRP在调节m RNA翻译、运输和稳定等方面起着至关重要的作用。在神经元细胞中,FMRP对与之结合的m RNA的转录及翻译后修饰进行调节,影响下游蛋白的表达;在细胞质与细胞核之间穿梭的FMRP改变m RNA的亚细胞定位;神经发生和突触的可塑性也受其影响。小鼠的体内和体外实验显示,从成体神经干细胞中敲除FMRP会导致海马神经元的降低,并显著地影响海马依赖的学习记忆。此外,FMRP的缺失会促进成体神经干细胞的增殖而改变其分化命运。micro RNA(miRNA)是一类平均长度约为22个核苷酸的,由内源基因编码的单链非编码RNA。目前已证实,mi RNA广泛存在于真核生物细胞中,通过对靶分子m RNA的转录后水平的调控,在生物个体器官的形态建成、细胞增殖与分化、细胞周期、凋亡、个体发育、成体干细胞以及胚胎干细胞的发育进程等一系列重要的生命活动中进行调节。在目前发现的micro RNA中,有70%在哺乳动物的脑中存在,提示micro RNA在神经系统及神经疾病的发生中有着极其重要的作用。本研究采用生物信息学的方法预测以小鼠FMR1基因作为靶标的miRNA,发现用三个在线靶基因预测软件(Target Scan Mouse,mi Randa,mi RDB)预测到500个mi RNA可以靶向FMR1的3’UTR区,其中用2个软件预测到的mi RNA有164个,用3个软件共同预测到的mi RNA有61个。在这61个备选mi RNA中,有18个在脑组织中高度表达。双荧光素酶报告分析(Luciferase reporter assay)显示,与对照组相比,其中mmu-mi R-19a、mmu-mi R-23a、mmu-mi R-25、mmu-mi R-32、mmu-mi R-92a、mmu-mi R-124、mmu-mi R-130b、mmu-mi R-301、mmu-mi R-325、mmu-mi R-335、mmu-mi R-350和mmu-mi R-367可以显著降低含有FMR1 3’UTR的报告基因载体的荧光素酶的活性,提示FMR1可能为这些mico RNA的靶基因。采用逆转录病毒载体在小鼠胚胎神经干细胞中过表达和表达下调miRNA,然后通过q RT-PCR和Western blot等实验观察FMR1基因的表达,发现mmu-mi R-124和mmu-mi R-130b能够在m RNA水平和蛋白水平抑制FMR1基因的表达。免疫组化分析显示:mmu-miR-124和mmu-miR-130b通过抑制FMR1基因的表达,从而促进小鼠神经干细胞增殖,并改变小鼠神经干细胞的分化命运,抑制神经元分化而促进神经胶质细胞分化。q RT-PCR和Western blot分析表明:mmu-mi R-124和mmu-mi R-130b通过抑制FMR1基因的表达调节细胞周期和wnt信号通路特定mRNA的翻译,从而改变小鼠神经干细胞增殖和分化命运。本研究鉴定出在FXS综合征中发挥作用的mi RNA,为进一步揭示FXS综合征的分子机制提供理论基础,为FXS综合征的诊断或新药开发提供新的思路。