论文部分内容阅读
目的：我们课题组前期研究应用microRNA芯片技术筛选出肝癌组织差异表达microRNAs,发现miR-16在肝癌组织中表达下调。初步预实验发现miR-16在单核细胞中高表达,而在体外诱导的M2型巨噬细胞中miR-16表达下调,提示miR-16的下调可能与巨噬细胞向M2型分化有关。本项目进一步探索miR-16对M2型巨噬细胞分化的调控作用,明确调节miR-16表达水平升高对巨噬细胞表型和功能分化的影响。本研究将揭示调控巨噬细胞分化的关键microRNA分子,为阻断巨噬细胞向M2型激活提供潜在干预靶点,也为调节抗肿瘤免疫提供新的思路。方法：1.为了明确miR-16在M2型巨噬细胞分化过程中的表达变化,将45ng/ml的IL-4加入人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1),使其分化为M2型巨噬细胞,用ELISA法检测巨噬细胞诱导前后IL-10的分泌情况,用Real-time PCR法检测巨噬细胞诱导前后miR-16的表达情况。2.建立miR-16过表达细胞株：首先构建miR-16过表达慢病毒载体；其次选用THP-1细胞系,将其体外诱导成M2型巨噬细胞,加入辅助感染试齐polybreen以及LV-hsa-mir-16-1病毒,培养48小时以后观察细胞状态,并更换为新鲜培养基,加入嘌呤霉素(Puromycin)筛选,以提高感染效率。感染3-4天后,观察荧光表达情况。感染5天后,进行下游实验；用流式细胞术、Real-time PCR法等分别检测感染效率,评价miR-16的过表达情况。3.为了明确调节miR-16表达水平升高对巨噬细胞表型和功能分化的影响：用PI染色检测过表达miR-16对M2型巨噬细胞细胞周期的影响；用ELISA法检测M2型巨噬细胞miR-16过表达组和对照组上清液中IL-10的分泌情况；用流式细胞术检测过表达组和对照组胞内IL-10的表达情况；用Western blot法检测过表达组和对照组精氨酸蛋白酶-1(arginase-1, Argl)的表达情况。结果：1.THP-1细胞系经IL-4诱导后,上清中IL-10的分泌逐渐增加,诱导至6-7d达峰值,提示M2型巨噬细胞体外诱导成功。检测诱导前后miR-16的相对表达水平发现：IL-4激活单核细胞为M2型巨噬细胞后,miR-16表达下调。2.M2型巨噬细胞经慢病毒感染,嘌呤霉素筛选后,流式细胞仪检测GFP表达率提高至97.7%。统计学结果显示：过表达组中miR-16基因的表达水平可以达到阴性对照组的7.644±0.110倍(P<0.05)。3.M2型巨噬细胞经慢病毒感染过表达miR-16后,对照组在G1/G0期细胞的比例为54.67%,而过表达组在G1/G0比例则增至62.25%；过表达组在S期细胞的比例为36.31%,低于对照组在S期细胞的比例(42.12%),提示：miR-16引起细胞周期G1期阻滞(P值<0.05)。4. ELISA法检测M2型巨噬细胞miR-16过表达组上清液中IL-10的分泌量为72.15±0.158pg/ml,较对照组(103.47±0.136pg/ml)低(P<0.05)。流式细胞术检测M2型巨噬细胞过表达组和对照组IL-10胞内染色差异显示：过表达组IL-10的平均荧光强度Gm为3.47,胞内IL-10的表达水平较对照组(Gm=12.40)低(P<0.05)。Western blot法检测M2型巨噬细胞精氨酸蛋白酶-1(arginase-1, Argl)的表达情况,各组Argl表达相对值即Argl/β-actin的灰度值比值分别为：阴性对照组0.4565±3.14%,过表达组0.1158±2.83%。阴性对照和过表达组之间Arg1表达相对值的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：IL-4激活单核细胞为M2型巨噬细胞后,miR-16表达下调。通过慢病毒感染,过表达miR-16后,M2型巨噬细胞细胞周期G1期阻滞,上清和胞内IL-10的分泌均下调,Argl蛋白表达水平同时下调,提示miR-16影响M2型巨噬细胞的表型和功能,对M2型巨噬细胞产生了一定程度的重塑作用。