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目的:金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人类化脓感染中最常见的病原菌,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎及败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一,许多国家都设有专门机构,应对金葡菌的院内感染问题。随着内酰胺类抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增加,且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。MRSA可通过接触途径进行传播,即易感人群从携带者或感染者身上获得MRSA,导致传播流行。腺苷酰转移酶是一种跨膜多重药物外排蛋白,介导了葡萄球菌对氨基糖苷类药物(主要是亲水性氨基糖苷类药物)及多种结构上近似甚至无关的药物耐药。该菌对多种广谱抗菌药物耐药,给临床治疗带来很大困难。因此,对其耐药机制、耐药基因的传播与转移的研究具重要的临床意义。本研究首次对临床分离SA氨基糖苷类耐药基因adenylyltransferase gene、氟喹诺酮耐药基因Nor A进行克隆、测序、表达及初步功能研究,为进行Adenylyltransfe rase、Nor A蛋白高级结构测定的结晶试验提供必须材料,同时对耐药基因的深入功能研究奠定基础,为从分子水平开展医院SA耐药株感染的控制和监测提供依据。方法:取SA临床分离株复苏、鉴定。采用离心柱型DNA抽提纯化试剂盒提取SA染色体DNA,根据Genbank公布的SA基因序列设计特异性引物,以染色体DNA为模板,通过PCR技术扩增adenylyltransferase、Nor A全基因,PCR产物纯化后与p GEX-4t-1载体连接,连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α,挑取经氨苄筛选的阳性菌落提取质粒并经双酶切及测序鉴定。转化大肠杆菌E.coli BL21,经双酶切鉴定后以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹法(Western blot)分析表达结果;并对p GEX-4T-1-adenylyltransferase/BL21重组株进行氨基糖苷类类药敏实验。另收集临床分离的22株金黄色葡萄球菌,采用PCR法检测adenylyltransferase、Nor A基因的携带率。结果:复苏的细菌经再鉴定确定为SA,以SA染色体DNA为模板,PCR扩增出两个大小分别约783bp、1167bp左右的片段并将其成功克隆入T载体。序列比对分析显示adenylyltransferase开放阅读框长783bp,编码29.9k Da蛋白;NORA开放阅读框长1167bp,编码43.9k Da蛋白。成功构建高效表达载体p GEX-4T-1-adenylyltransferase/NORA,经IPTG诱导分别获得分子量约55k Da、69k Da的融合表达蛋白,与预期分子量相符。重组体大肠杆菌药敏结果显示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC与p GEX-4T-1/BL21相比仅CIP有2级浓度差异,其余结果一样。22株金黄色葡萄球菌中检出腺苷酰转移酶耐药基因9株,检出率为40%;NORA基因12株,检出率为45%。结论:成功构建了金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因adenylyltransferase、耐氟喹诺酮耐药基因Nor A的T载体及高效原核表达载体p GEX-4T-1-adenylyltransferase/Nor A/并获得2个重组蛋白的大量表达;重组体大肠杆菌药敏结果显示,p GEX-4T-1-NORA/BL21的MIC与p GEX-4T-1/BL21相比仅CIP有2级浓度差异,其余结果一样。22株临床分离金黄色葡萄球菌携带adenylyltransferase、NORA基因的比率分别为45%、40%。