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荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是盛产于热带、亚热带特色水果。荔枝果皮占整果的16%,且含有多种功能活性物质。本文研究了采用Aspergillus awamoriGIM3.4对荔枝果皮中多酚、多糖进行转化,以期得到具有更高生物活性的化合物。主要的研究内容及结果如下:
(1)研究了3株致病菌(Peronophythora litchii,Colletotrichumgloeosporiodes,Fusarium proliferatum)和一株未知菌种,以及购自广东微生物保持中心的3株霉菌(Aspergillus awamori GIM3.4,Aspergillus sojae GIM3.33和Aspergillus oryzae GIM3.32)对荔枝果皮提取物和荔枝果皮粉末的化合物进行转化,并评价了转化后产物的总酚、总黄酮的含量以及DPPH自由基清除活性。研究结果表明4株致病菌对荔枝果皮酚类物质具有较强的降解作用,其产物的DPPH自由清除活性不高;采用A.awamori GIM3.4固态发酵后的产物具有较高总酚、总黄酮含量以及较高DPPH自由基清除活性。
(2)以经60%乙醇提取后的荔枝果皮残渣为发酵底物,研究了A.awamoriGIM3.4对荔枝果皮中不可提取物质的转化。发酵产物经提取后用硅胶柱、Sephadex LH-20柱以及高效反向制备色谱进行分离纯化并得到转化产物单体,利用一维和二维NMR以及ESI-MS对产物进行结构分析。结果表明果皮残渣经转化后产生了豆甾醇、异落叶松脂素、二氢菜豆酸、山奈酚、槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖苷、山奈酚-3-葡萄糖苷和Nigragillin;分析了异落叶松脂素、二氢菜豆酸、Nigragillin的DPPH自由基清除活性和DNA保护活性,发现异落叶松脂素具有较强的DPPH自由基清除活性(1 mg/ml清除率60%),而没有DNA保护活性,二氢菜豆酸有较强的DNA保护活性,没有DPPH自由基清除活性;Nigragillin表现出了一定的DPPH自由基清除活性,同时低浓度(100μg/ml)的Nigragillin表现出了一定的DNA保护活性,而高浓度(300μg/ml)则促进DNA降解。
(3)以荔枝全果皮粉末和经60%乙醇提取后的荔枝果皮残渣为发酵底物,分析了经A.awamori GIM3.4发酵后荔枝果皮以及经60%乙醇提取后的荔枝果皮残渣提取液中总单宁及其平均聚合度的变化,发现经A.awamori GIM3.4发酵后荔枝全果皮提取物总单宁含量从1286.58±13.87μg/g DW增加到1456.12±15.7295μg/g DW,而残渣提取物的总单宁含量从199.92±14.47μg/g DW增加到318.38±7.59μg/g DW,单宁平均聚合度也显著增加,这说明发酵促进荔枝果皮中不可提取的缩合单宁的溶出;进一步采用从荔枝果皮提取液中分离纯化得到的缩合单宁为底物研究A.awamori GIM3.4对缩合单宁的转化作用,应用HPLC-ESI-MS和ESI-TOF-MS分析了发酵前后单宁的变化。发现A.awamori GIM3.4对以表儿茶素为结构单元,通过碳碳单键缩合(B型连接)而成的缩合单宁具有较强的降解作用,而对含有黄烷-3-醇没食子酸酯结构单元、A型双键连接单元、以及没食子儿茶素和阿福精素结构单元的缩合单宁降解作用较弱。
(4)选取荔枝果皮提取物中的主要化合物(表儿茶素、原花青素A2、芦丁、槲皮素-3-葡萄糖苷)作为底物,研究了A.awamori GIM3.4对上述化合物的生物转化。研究结果表明,A.awamori GIM3.4对表儿茶素、原花青素A2没有转化作用,同时发现A.awamori GIM3.4的营养生长能够保护表儿茶素、原花青素A2在摇瓶发酵过程中免受培养液中溶解氧的破坏;A.awamori GIM3.4对芦丁具有去糖苷、C-3去羟基化等作用,而对槲皮素-3-葡萄糖苷、山奈酚-3-葡萄糖苷只有去糖苷化作用而没有去羟基化的作用。
(5)研究了A.awamori GIM3.4对荔枝果皮多糖的生物转化,发现A.awamori GIM3.4发酵产生的酶能够切断荔枝果皮多糖中的以(1,6)的葡萄糖苷和(1,4)连接的阿拉伯糖苷,从而使多糖的分子量降低(分子量从98.5 kDa降到9.8 kDa),DPPH自由基清除活性增大2倍、对保加利亚乳杆菌增值活性增大4倍和嗜热链球菌的增值活性增大2倍,DNA保护活性活性也显著增加。