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斑蝥素(cantharidin)又称芫菁素,是由鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)昆虫产生的蔽类防御物质,具有重要的实用价值。探索斑蝥素的生物合成路径有助于实现对斑蝥素的大规模开发利用。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是MVA途径下游分支点的关键酶,探索其与斑蝥素生物合成的关系将会加深我们对斑蝥素合成路径的认识。本研究的目的主要由两个:一是通过RT-PCR与RACE技术相结合的手段克隆中华豆芫菁(EpicautachinensisLaporte)FPPS基因,并用一系列生物信息学软件分析并预测该基因的生物学功能;二是通过RNAi技术干扰FPPS mRNA在中华豆芫菁体内的表达,通过RT-qPCR技术检测不同实验组试虫体内FPPSmRNA表达量,确定RNA干扰效果,并通过气相色谱内标法检测各组试虫体内的斑蝥素含量,进而推断出二者之间的关系。本实验的主要研究成果如下:1.获得中华豆芫菁Echinensis法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长cDNA序列,命名为EcFPPS(GenBank登录号KC758147),序列分析结果表明,该基因全长1 842bp,其中5’非编码区144 bp,3’非编码区423bp,开放阅读框1 275 bp,共编码424个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD,理论等电点pI为8.89,预测分子式为C2188H6604N34520635S24,不稳定系数为38.68,总平均亲水系数为-0.449,为疏水的稳定蛋白。序列分析发现,中华豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的相似性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和2个典型的DD**D的天冬氨酸富含区。与已知的20余种昆虫FPPS氨基酸构建的系统发育树显示中华豆芫菁E.chinensis与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)FPPS氨基酸的进化关系最近。EcFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有1段明显的线粒体靶向肽。2.对中华豆芫菁雄虫交尾后0、2、4、6、8和10天体内斑蝥素含量及FPPS mRNA表达量的测定结果显示,雄虫体内斑蝥素含量在刚交尾结束时很低,但到第2天时斑蝥素含量已增加了4倍,紧接着在交尾后第4天斑蝥素达到峰值,约为刚交尾后试虫体内斑蝥素含量的17倍,由此我们可以推断雄虫在完成交尾后重新合成了斑蝥素。同样时间内,FPPS mRNA表达量在交尾后第2天略有增加,随后维持稳定。相关性分析显示二者无显著的相关性,初步推测FPPS基因在转录水平的表达量可能与斑蝥素的生物合成关系不大。3.通过RT-qPCR技术检测了交尾后第2、4、6、8、10天内不同实验组试虫体内FPPS mRNA表达量,结果显示RNAi技术成功地抑制了中华豆芫菁雄虫FPPS mRNA的表达,抑制率在93%以上。对不同处理组试虫体内斑蝥素含量检测表明,在FPPS mRNA表达正常的情况下,斑蝥素含量在交尾后第四天达到峰值,随后稍有降低并维持在这一稳定水平;当FPPSmRNA表达量受到抑制时,斑蝥素的含量在交尾后第2天即到达稳定水平。这表明,FPPS被干扰后,中华豆芫菁体内仍能继续合成斑蝥素,且斑蝥素含量达到稳定水平的时间也提前了。本研究首次克隆得到了中华豆芫菁FPPS基因的全长cDNA序列,并对其进行了相关的生物信息学分析,并基于RNAi技术成功地抑制了交尾后中华豆芫菁雄虫体内FPPS基因编码mRNA的表达量,得出斑蝥素在FPPS被干扰后,中华豆芫菁仍能继续合成斑蝥素,且达到稳定水平的斑蝥素含量与对照组试虫无显著性差异。但值得注意的是FPPS被干扰后中华豆芫菁雄虫体内斑蝥素含量达到稳定含量的时间也提前了。这表明,FPPS基因在转录水平的表达量的变化对斑蝥素生物合成的影响不大。