灰飞虱Laodelphax striatelus(半翅目、飞虱科)作为亚洲水稻生产中的重要害虫,能够传播水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引发水稻条纹叶枯病,造成重大损失。RSV的侵入伴随着灰飞虱体内多种组分与病毒的互作,这些组分能够抵御或帮助病毒侵染、复制和传播。前期研究鉴定出带毒与不带毒灰飞虱唾液腺中的33个差异蛋白,其中包括泛素相关蛋白,如泛素-60s核糖体L40前体。泛素(Ub)被泛素激活酶(E1)激活后,通过硫酯键与泛素结合酶(E2)相连,随后在泛素连接酶(E3)的催化下,泛素被标记到靶蛋白上,被标记的靶蛋白最终被26s蛋白酶体识别并降解。这种泛素化修饰过程调控真核生物细胞中80%以上的蛋白降解,几乎参与了所有的生命活动,同样也在寄主-病毒关系中发挥重要作用。本论文主要研究了灰飞虱泛素结合酶E2对RSV在虫体内积累的影响并探索其初步机制,主要结果如下:1、灰飞虱E2的全长克隆及表达模式根据前期获得的转录组序列,利用RACE-PCR技术克隆出灰飞虱体内4个不同E2序列全长,分别为1089bp、1209bp、854bp、1303bp;分析其结构发现,4条序列的三级结构分别匹配E2A、E2 E、E2 G2、E2H4个不同E2亚型模型,并且分别含有长度为154、188、144、184个氨基酸的泛素结合结构域UBC;构建统发育进化树后发现E2 4个亚型的分化程度较高,可能行使不同的功能。后利用荧光定量技术分别检测4个亚型在灰飞虱体内的时空表达模式,发现4个亚型在灰飞虱不同龄期和不同组织中均有表达,其中A、E、H亚型在中肠中表达量较高,而G2亚型在卵巢中高表达;并且四者均在羽化后3天出现表达峰值。这表明在相应组织和龄期阶段不同E2可能扮演不同的角色。2、灰飞虱体内E2对RSV的抑制作用及机制利用荧光定量技术检测携带RSV灰飞虱与无毒灰飞虱体内4个亚型的基因表达情况,发现带毒灰飞虱体内E2的4个亚型普遍高表达,提示四者在RSV侵染灰飞虱过程中可能发挥一定作用。进一步利用RNAi技术分别沉默4个亚型,结果表明仅沉默E亚型的表达对灰飞虱体内RSV载量有影响;利用荧光定量、免疫印迹分析和免疫荧光共聚焦技术针对E亚型进一步研究,发现E亚型表达被抑制后会导致RSV Cp的基因表达和蛋白表达均显著上调,并且在中肠、唾液腺和卵巢中也检测到Cp含量增多,表明灰飞虱的E2 E亚型能够抑制RSV的复制积累。利用酵母双杂交验证得出E亚型泛素结合酶与RSV所编码的Cp、Sp、NS2、NS3、NSVC4和RdRp均不互作后,又利用酵母双杂交和GST pull-down技术验证发现E亚型可以和与RSV互作的E3泛素连接酶互作。我们推测灰飞虱体内E亚型泛素结合酶可能激活灰飞虱体内抗病毒相关反应,亦可能在E3的催化作用下泛素化降解病毒,达到抑制病毒的复制积累的目的;而不是通过直接互作来影响RSV的积累。后续需要更多的实验验证我们的推测。