论文部分内容阅读
糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是一种由糖尿病引发的微血管并发症。1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）患者血糖达标率低,DKD发生率高。肾小球系膜基质中胶原蛋白及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的积聚是DKD的重要病理变化之一。肾小球系膜细胞在高血糖状态下的自噬活性降低参与系膜基质中的蛋白积聚,而肾小球系膜细胞自噬活性的增强可缓解高血糖导致的肾损伤,保护肾功能。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）及白藜芦醇（resveratrol,RSV）可缓解高血糖导致的肾损伤,其机制尚未完全明确。现有研究表明白藜芦醇可降低高血糖状态下肾小球内皮细胞、足细胞及系膜细胞的氧化应激水平,MSCs可减少足细胞凋亡,而氧化应激和细胞凋亡均与自噬功能紧密相关。因此,MSCs及白藜芦醇能否调节高血糖状态下肾组织细胞的自噬水平,自噬是否参与MSCs及白藜芦醇对DKD的保护作用有待进一步探究。目的:对T1DM模型小鼠进行MSCs联合白藜芦醇干预,研究其对肾脏的保护作用。观察高葡萄糖培养环境中MSCs联合白藜芦醇干预对小鼠肾小球系膜细胞自噬活性的影响,探索其可能的分子机制。方法:本研究从整体水平、细胞水平和分子水平三个维度,观察了MSCs联合白藜芦醇干预在T1DM模型小鼠肾脏形态和功能方面的保护作用,检测了小鼠肾组织自噬水平变化及其在肾脏保护中的作用,并探索了可能的分子机制。在整体水平上,建立NOD小鼠T1DM模型,随机分为糖尿病对照组（DM-Ctrl）、胰岛素治疗组（Insulin）、MSCs治疗组（MSCs）、白藜芦醇治疗组（RSV）和MSCs联合白藜芦醇治疗组（MSCs+RSV）。T1DM建模成功后干预16周。饲养全过程血糖无明显升高的小鼠作为血糖正常对照组（NG）。监测各组实验动物体重、血糖及一般情况变化,第8周及第16周时处死实验动物采集组织标本。尿白蛋白/尿肌酐（UACR）检测评估实验动物肾功能,HE染色、PAS染色和Masson染色观察肾脏形态变化,Western blot检测肾脏I型胶原蛋白（type I collagen,Col-I）、IV型胶原蛋白（type IV collagen,Col-IV）及FN的沉积情况,综合以上指标评估各实验组动物肾脏损伤程度。Western blot检测自噬通路标志蛋白p62和LC3肾脏内水平的改变。在细胞水平上,高葡萄糖环境培养小鼠肾小球系膜细胞,分别予MSCs、白藜芦醇、MCSs联合白藜芦醇干预,应用Western blot及qRT-PCR检测自噬相关因子p62、LC3和LAMP-1蛋白及mRNA水平的变化,评估高葡萄糖环境下MSCs及白藜芦醇对小鼠肾小球系膜细胞自噬活性的影响。在分子水平上,使用MSCs对小鼠肾小球系膜细胞进行干预,通过Western blot及qRT-PCR检测系膜细胞自噬调节因子Beclin 1蛋白及mRNA水平的变化;应用shRNA构建beclin 1 knockdown的小鼠肾小球系膜细胞模型,观察MSCs处理后细胞p62、LC3-II/I蛋白水平的变化,评估细胞自噬活性的改变。使用白藜芦醇对小鼠肾小球系膜细胞进行干预,通过Western blot及qRT-PCR检测系膜细胞自噬调节因子AMPK蛋白表达水平、磷酸化水平及mRNA水平的变化;应用shRNA构建Prkaa1 knockdown的小鼠肾小球系膜细胞模型,观察白藜芦醇处理后细胞p62、LC3-II/I蛋白水平的变化,评估细胞自噬活性的改变。结果:1.观察T1DM模型小鼠的一般情况。血糖升高后,小鼠饮水量及尿量增多,且DM-Ctrl组小鼠较其余各组体重明显下降。Insulin组、RSV组、MSCs组及MSCs+RSV组小鼠的外源胰岛素用量依次减少。2.检测T1DM模型小鼠的UACR水平,评估其肾功能。糖尿病发病8周后,DM-Ctrl组及Insulin组UACR较NG组显著升高,其余各组无显著性差异;糖尿病发病16周后,MSCs+RSV治疗组UACR显著低于Insulin组、MSCs组及RSV组。3.观察T1DM模型小鼠的肾脏形态学变化。测量肾小球体积,糖尿病发病8周后,DM-Ctrl组小鼠肾小球体积增大;糖尿病发病16周后,糖尿病各组（包括DM-Ctrl,Insulin,MSCs,RSV和MSCs+RSV组）小鼠肾小球体积均增大,其中MSCs+RSV组肾小球体积增幅最小。检测肾脏糖原含量,糖尿病发病8周后,DM-Ctrl组及Insulin组小鼠肾糖原含量高于NG组,且NG组、MSCs组、RSV组及MSCs+RSV四组间无显著性差异;糖尿病发病16周后,MSCs组、RSV组及MSCs+RSV组小鼠肾糖原含量低于Insulin组,MSCs+RSV组低于MSCs组及RSV组。4.评估T1DM模型小鼠肾组织纤维化程度。检测肾脏Col-I水平,糖尿病发病8周后,仅DM-Ctrl组的Col-I水平高于NG组;糖尿病发病16周后,DM-Ctrl组和Insulin组的Col-I水平高于NG组,MSCs+RSV组的Col-I水平低于Insulin组。检测肾脏Col-IV水平,糖尿病发病8周后,糖尿病各组的Col-IV水平均高于NG组;糖尿病发病16周后,糖尿病各组的Col-IV水平均高于NG组,其中MCSs组、RSV组和MSCs+RSV组的Col-IV水平低于Insulin组,MSCs+RSV组的Col-IV水平低于MSCs组及RSV组。检测肾脏FN水平,糖尿病发病8周后,各组的FN水平无显著性差异;糖尿病发病16周后,糖尿病各组的FN水平均高于NG组,其中MCSs组、RSV组和MSCs+RSV组的FN水平低于Insulin组,MSCs+RSV组的FN水平低于MSCs组及RSV组。5.评估T1DM模型小鼠肾组织内质网应激和氧化应激变化。检测肾脏PERK及p-PERK水平,各组在8周及16周的PERK及p-PERK水平均无显著性差异。检测肾脏Nrf2水平,糖尿病发病16周后,糖尿病各组的Nrf2水平均高于NG组,其中RSV组和MSCs+RSV组的Nrf2水平低于Insulin组,MSCs+RSV组的Nrf2水平低于RSV组。检测肾脏NF-κB-65水平,糖尿病发病16周后,糖尿病各组的NF-κB-65水平均高于NG组,其中MSCs组、RSV组和MSCs+RSV组的NF-κB-65水平低于Insulin组,MSCs+RSV组的NF-κB-65水平低于MSCs组和RSV组。6.评估T1DM模型小鼠肾组织自噬功能变化。检测肾脏p62水平,糖尿病发病8周后,除MSCs+RSV组外糖尿病各组的p62水平均高于NG组,MSCs+RSV组的p62水平低于Insulin组;糖尿病发病16周后,DM-Ctrl组、Insulin组和RSV组的p62水平高于NG组,MSCs组和MSCs+RSV组的p62水平低于Insulin组和RSV组。检测肾脏LC3水平,糖尿病发病8周后,DM-Ctrl组和Insulin组的LC3-II/I比值低于NG组,MSCs组、RSV组和MSCs+RSV组的LC3-II/I比值高于Insulin组,其中MSCs+RSV组的LC3-II/I比值高于MSCs组和RSV组;糖尿病发病16周后,DM-Ctrl组和Insulin组的LC3-II/I比值低于NG组,MSCs组、RSV组和MSCs+RSV组的LC3-II/I比值高于Insulin组,其中MSCs+RSV组的LC3-II/I比值高于MSCs组和RSV组。7.评估高糖环境培养的小鼠肾小球系膜细胞自噬功能变化。检测细胞p62水平,结果显示MSCs+RSV-细胞、MSCs-RSV+细胞和MSCs+RSV+细胞的p62水平低于MSCs-RSV-细胞,MSCs+RSV+细胞的p62水平低于MSCs+RSV-细胞和MSCs-RSV+细胞。检测细胞LC3水平,结果显示MSCs+RSV-细胞、MSCs-RSV+细胞和MSCs+RSV+细胞的LC3-II/I比值高于MSCs-RSV-细胞,MSCs+RSV+细胞的LC3-II/I比值高于MSCs+RSV-细胞和MSCs-RSV+细胞。应用chloroquine（CQ）后,检测细胞p62水平,结果显示MSCs+RSV-CQ+细胞、MSCs-RSV+CQ+细胞和MSCs+RSV+CQ+细胞的p62水平高于MSCs-RSV-CQ+细胞,MSCs+RSV+CQ+细胞的p62水平高于MSCs+RSV-CQ+细胞和MSCs-RSV+CQ+细胞。应用CQ后,检测细胞LC3水平,结果显示MSCs+RSV-CQ+细胞、MSCs-RSV+CQ+细胞和MSCs+RSV+CQ+细胞的LC3-II/I比值高于MSCs-RSV-CQ+细胞,MSCs+RSV+CQ+细胞的LC3-II/I比值高于MSCs+RSV-CQ+细胞和MSCs-RSV+CQ+细胞。8.检测MSCs处理的小鼠肾小球系膜细胞基因表达水平变化,结果显示高糖培养环境中,MSCs处理的细胞beclin 1 mRNA及蛋白水平升高。检测beclin 1knockdown的小鼠肾小球系膜细胞自噬功能变化,结果显示高糖培养环境中,MSCs+CQ+细胞的p62和LC3-II/I水平与MSCs-CQ+细胞无显著性差异。9.检测白藜芦醇处理的小鼠肾小球系膜细胞AMPK水平变化,结果显示高糖培养环境中,RSV+细胞的Prkaa1 mRNA和蛋白水平与RSV-细胞无显著性差异,RSV+细胞的p-AMPKThr172水平高于RSV-细胞。检测Prkaa1 knockdown的小鼠肾小球系膜细胞自噬功能变化,结果显示高糖培养环境中,RSV+CQ+细胞的p62和LC3-II/I水平与RSV-CQ+细胞无显著性差异。结论:1.MSCs或白藜芦醇单独使用均可对T1DM模型小鼠发挥肾脏保护作用,且二者联合使用的肾脏保护效果更为显著。MSCs联合白藜芦醇可减少肾组织纤维化和糖原沉积,缓解肾脏形态学改变,并减少尿蛋白排出,保护肾脏功能。2.在T1DM模型小鼠中,MSCs联合白藜芦醇可引起肾组织自噬通路标志蛋白水平变化,提示MSCs联合白藜芦醇可调节T1DM模型小鼠肾脏细胞的自噬功能。3.高糖培养环境可抑制小鼠肾小球系膜细胞的自噬功能,MSCs联合白藜芦醇处理可使减弱的自噬活性得以恢复。4.在高糖培养环境下,MSCs可提高小鼠肾小球系膜细胞Beclin 1表达水平,从而增强细胞的自噬功能。5.在高糖培养环境下,白藜芦醇可提高小鼠肾小球系膜细胞AMPK磷酸化水平,从而增强细胞的自噬功能。