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泌乳性状是奶山羊产业的重要经济性状。我国是世界上奶山羊存栏数最多的国家，但奶中乳蛋白较低，影响奶制品的质量，乳蛋白低已成为制约我国奶山羊产业快速发展的瓶颈问题。近年来，研究发现circRNA、miRNA和靶基因可以调控乳腺的发育和乳汁的生成。课题组前期的研究结果显示，miR-8516在泌乳前期与泌乳高峰期的乳腺组织中差异表达显著，但其对奶山羊乳腺的发育及泌乳的影响尚不清楚。利用生物信息学分析发现circRNA8220含有能与miRNA-8516种子序列结合的部位，STC2基因的3UTR也存在能与miRNA-8516反向互补的碱基序列，推测circRNA8220能通过吸附miRNA-8516调节靶基因STC2的表达进而影响奶山羊乳腺上皮细胞。
本试验以奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs)为研究对象，利用Westernblot、EDU、细胞凋亡等试验方法，分析circRNA8220/miRNA-8516/STC2之间的调节关系，研究circRNA8220/miRNA-8516/STC2对GMECs的增殖、凋亡及泌乳的调控作用以及对PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK通路中关键因子的磷酸化的影响。以期揭示circRNA8220/miRNA-8516/STC2对GMECsβ-酪蛋白和甘油三酯调控的分子机理，为奶山羊泌乳调控以及精准育种提供科学依据。主要试验结果如下：
1．circRNA8220吸附miR-8516降低其表达量
双荧光素酶检测结果显示，circRNA8220能与miR-8516结合。RT-qPCR结果显示，干扰circRNA8220后能显著升高miRNA-8516的表达量，过表达circRNA8220后能显著降低miRNA-8516的表达量(P＜0.05)。同样，将miR-8516mimics转染GMECs后，circRNA8220的表达量显著降低(P＜0.05)。结果表明，circRNA8220与miRNA-8516之间存在拮抗关系，且circRNA8220可吸附miR-8516，抑制GMECs中miR-8516的表达量。
2．circRNA8220吸附miR-8516进而调节靶基因STC2的表达
双荧光素酶检测结果表明，miRNA-8516能与基因STC2结合。RT-qPCR和Westernblot结果显示，miR-8516能显著降低STC2mRNA和蛋白表达(P＜0.05)，miR-8516inhibitor能显著增加STC2蛋白表达(P＜0.05)，结果表明STC2为miR-8516的靶基因。RT-qPCR、Westemblot检测发现circRNA8220过表达能显著增强STC2mRNA和蛋白表达(P＜0.01)，circRNA8220干扰后能显著降低STC2mRNA和蛋白表达(P＜0.01)，结合本试验结果1可知，circRNA8220可作为ceRNA吸附miRNA-8516上调GMECs中STC2的表达。
3．circRNA8220和STC2抑制GMECs的凋亡以及促进GMECs的增殖
EdU、CCK-8结果显示，干扰STC2、circRNA8220能抑制GMECs的增殖(P＜0.05)，过表达STC2、circRNA8220能促进GMECs的增殖(P＜0.05)，circRNA8220对GMECs增殖的影响趋势与STC2-致。流式细胞仪检测结果显示，干扰STC2、circRNA8220能显著促进GMECs的凋亡(P＜0.01)，过表达STC2、circRNA8220能显著抑制GMECs的凋亡(P＜0.01)，circRNA8220对GMECs凋亡的影响趋势与STC2一致。过表达circRNA8220与STC2能显著降低凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase9的表达量，升高Bcl-2的表达量(P＜0.05)，干扰circRNA8220与STC2能显著升高凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase9的表达量，降低Bcl-2的表达量(P＜0.05)，凋亡基因蛋白表达量的变化进一步表明circRNA8220、STC2能抑制GMECs的凋亡。Westernblot结果可知，分别干扰STC2以及circRNA8220能下调Ras、p-MEK/MEK、p-ERK44/ERK44、p-ERK42/ERK42的表达水平，分别过表达STC2、circRNA8220能上调Ras、p-MEK/MEK、p-ERK44/ERK44、p-ERK42/ERK42的表达水平。以上结果表明circRNA8220与STC2通过激活Ras/MEK/ERK通路抑制GMECs的凋亡。
4．circRNA8220和STC2促进GMECs中β-酪蛋白和甘油三酯的分泌
ELISA结果表明，分别干扰STC2、circRNA8220能抑制GMECs甘油三酯和β-酪蛋白的分泌，而分别过表达STC2、circRNA8220能促进GMECs甘油三酯和β-酪蛋白的分泌。Westemblot结果表明：分别干扰STC2、circRNA8220能降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K的表达水平，分别过表达STC2以及circRNA8220能升高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K的表达水平。以上结果表明circRNA8220与STC2通过调控PI3K/AKT/mTOR通路调控GMECsβ-酪蛋白、甘油三酯的分泌。
综上所述，本试验揭示了circRNA8220作为ceRNA通过吸附miRNA-8516调控STC2进而调控Ras/MEK/ERK通路影响GMECs的凋亡；circRNA8220作为ceRNA通过吸附miRNA-8516调控STC2进而调控PI3K/AKT/mTOR通路影响GMECsβ-酪蛋白、甘油三酯的分泌。
本试验以奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs)为研究对象，利用Westernblot、EDU、细胞凋亡等试验方法，分析circRNA8220/miRNA-8516/STC2之间的调节关系，研究circRNA8220/miRNA-8516/STC2对GMECs的增殖、凋亡及泌乳的调控作用以及对PI3K/AKT/mTOR和Ras/MEK/ERK通路中关键因子的磷酸化的影响。以期揭示circRNA8220/miRNA-8516/STC2对GMECsβ-酪蛋白和甘油三酯调控的分子机理，为奶山羊泌乳调控以及精准育种提供科学依据。主要试验结果如下：
1．circRNA8220吸附miR-8516降低其表达量
双荧光素酶检测结果显示，circRNA8220能与miR-8516结合。RT-qPCR结果显示，干扰circRNA8220后能显著升高miRNA-8516的表达量，过表达circRNA8220后能显著降低miRNA-8516的表达量(P＜0.05)。同样，将miR-8516mimics转染GMECs后，circRNA8220的表达量显著降低(P＜0.05)。结果表明，circRNA8220与miRNA-8516之间存在拮抗关系，且circRNA8220可吸附miR-8516，抑制GMECs中miR-8516的表达量。
2．circRNA8220吸附miR-8516进而调节靶基因STC2的表达
双荧光素酶检测结果表明，miRNA-8516能与基因STC2结合。RT-qPCR和Westernblot结果显示，miR-8516能显著降低STC2mRNA和蛋白表达(P＜0.05)，miR-8516inhibitor能显著增加STC2蛋白表达(P＜0.05)，结果表明STC2为miR-8516的靶基因。RT-qPCR、Westemblot检测发现circRNA8220过表达能显著增强STC2mRNA和蛋白表达(P＜0.01)，circRNA8220干扰后能显著降低STC2mRNA和蛋白表达(P＜0.01)，结合本试验结果1可知，circRNA8220可作为ceRNA吸附miRNA-8516上调GMECs中STC2的表达。
3．circRNA8220和STC2抑制GMECs的凋亡以及促进GMECs的增殖
EdU、CCK-8结果显示，干扰STC2、circRNA8220能抑制GMECs的增殖(P＜0.05)，过表达STC2、circRNA8220能促进GMECs的增殖(P＜0.05)，circRNA8220对GMECs增殖的影响趋势与STC2-致。流式细胞仪检测结果显示，干扰STC2、circRNA8220能显著促进GMECs的凋亡(P＜0.01)，过表达STC2、circRNA8220能显著抑制GMECs的凋亡(P＜0.01)，circRNA8220对GMECs凋亡的影响趋势与STC2一致。过表达circRNA8220与STC2能显著降低凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase9的表达量，升高Bcl-2的表达量(P＜0.05)，干扰circRNA8220与STC2能显著升高凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase9的表达量，降低Bcl-2的表达量(P＜0.05)，凋亡基因蛋白表达量的变化进一步表明circRNA8220、STC2能抑制GMECs的凋亡。Westernblot结果可知，分别干扰STC2以及circRNA8220能下调Ras、p-MEK/MEK、p-ERK44/ERK44、p-ERK42/ERK42的表达水平，分别过表达STC2、circRNA8220能上调Ras、p-MEK/MEK、p-ERK44/ERK44、p-ERK42/ERK42的表达水平。以上结果表明circRNA8220与STC2通过激活Ras/MEK/ERK通路抑制GMECs的凋亡。
4．circRNA8220和STC2促进GMECs中β-酪蛋白和甘油三酯的分泌
ELISA结果表明，分别干扰STC2、circRNA8220能抑制GMECs甘油三酯和β-酪蛋白的分泌，而分别过表达STC2、circRNA8220能促进GMECs甘油三酯和β-酪蛋白的分泌。Westemblot结果表明：分别干扰STC2、circRNA8220能降低p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K的表达水平，分别过表达STC2以及circRNA8220能升高p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K的表达水平。以上结果表明circRNA8220与STC2通过调控PI3K/AKT/mTOR通路调控GMECsβ-酪蛋白、甘油三酯的分泌。
综上所述，本试验揭示了circRNA8220作为ceRNA通过吸附miRNA-8516调控STC2进而调控Ras/MEK/ERK通路影响GMECs的凋亡；circRNA8220作为ceRNA通过吸附miRNA-8516调控STC2进而调控PI3K/AKT/mTOR通路影响GMECsβ-酪蛋白、甘油三酯的分泌。