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第一章微滴式数字PCR技术筛选用于唐氏综合征无创产前筛查的差异甲基化基因
目的
本研究将基于母胎差异甲基化基因方法，筛选用于唐氏综合征无创产前筛查的胎儿标记物。通过高灵敏的微滴式数字PCR平台进行少量临床样本的验证，初步探究该方法的临床应用价值。
方法
(1)收集5例正常胎盘样本、5例唐氏综合征胎儿胎盘样本、5例正常非孕妇外周血样本，采用亚硫酸氢盐方法处理以上标本DNA。设计相应的引物，进行PCR扩增，根据电泳结果筛选差异甲基化基因，筛选后的基因进行测序分析以明确甲基化状态。
(2)选择2例正常胎盘、2例唐氏综合征胎儿胎盘及2例正常非孕妇外周血，按照胎盘DNA/(胎盘DNA+非孕妇外周血DNA)的50.00%、25.00%、15.00%、10.00%、5.00%，建立正常及唐氏综合征混合样本。采用亚硫酸氢盐方法及甲基化敏感的限制性内切酶方法处理混合样本DNA，选择胎盘中高甲基化、非孕妇外周血中低甲基化的基因用于目标基因与参照基因比值计算，根据混合样本的计算比值确定合适的目标基因及参照基因。
(3)选择8例正常孕妇外周血浆样本，采用亚硫酸氢盐方法及甲基化敏感的限制性内切酶方法处理混合样本DNA，评估差异甲基化基因的检出情况。
(4)回顾分析2017年1月至2017年3月在广东省妇幼保健院产前诊断中心进行介入性产前诊断手术的孕妇39例，采用甲基化敏感的限制性内切酶方法处理孕妇血浆样本DNA，评估该方法能否区分正常胎儿与唐氏综合征胎儿。
结果
(1)21号染色体上的HLCS基因、C21orf57基因及11号染色体上的PPFIA1基因均在胎盘中高甲基化，在非孕妇外周血中低甲基化。
(2)微滴式数字PCR最低可检测到5%的混合样本DNA，以HLCS/PPFIA1、C21orf57/PPFIA1建立比值时，能区分正常样本和唐氏综合征样本。
(3)8例正常临床样本DNA经甲基化敏感的内切酶消化后，微滴式数字PCR均能检测到HLCS基因、C21orf57基因及PPFIA1基因拷贝数。亚硫酸氢盐处理后的样本DNA，微滴式数字PCR只能检测2例晚孕期样本的HLCS基因及PPFIA1基因拷贝数。
(4)39例孕妇血浆样本DNA经甲基化敏感的内切酶消化后，除1例正常胎儿样本比值高于正常样本上限外，其余24例正常胎儿与14例唐氏综合征胎儿样本均正确分类。
结论
21号染色体上的差异甲基化基因HLCS、C21orf57基因可作为唐氏综合征筛查的胎儿特异性标记物，有望根据微滴式数字PCR计算的HLCS/PPFIA1、C21orf57/PPFIA1比值，进行唐氏综合征无创产前筛查的研究。
第二章微滴式数字PCR检测产前基因诊断样本的母体细胞污染的初步研究
目的
建立基于微滴式数字PCR平台的产前基因诊断样本母体细胞污染鉴定的新方法，对绒毛、羊水、脐血样本进行母体细胞污染鉴定，降低误诊漏诊的发生。方法
(1)选择夫妇双方均为同型β地贫基因携带者，基因型包括βN/βCD41-42、βN/βⅣS-Ⅱ-654、βN/β-28；胎儿地贫基因为βN/βN、βCD41-42/βCD41-42、βⅣS-Ⅱ-654/βⅣS-Ⅱ-654、β-28/β-28的家庭75例。
(2)按孕妇DNA/(孕妇DNA+胎儿DNA)的50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%、1.56%进行混合，建立以下样本的MCC梯度模型：βCD41-42/βCD41-42—βN/βCD41-42、βIVS-Ⅱ-654/βⅣS-Ⅱ-654—βN/βⅣS-Ⅱ-654、β-28/β-28—βN/β-28、βN/βN—βN/βCD41-42、βN/βN—βN/βⅣS-Ⅱ-654、βN/βN—βN/β-28，反向斑点杂交技术检测混合样本的地贫基因型，定量荧光PCR与微滴式数字PCR方法分别进行母体细胞污染鉴定。
(3)定量荧光PCR与微滴式数字PCR方法同时检测75例产前诊断样本，比较母体细胞污染检出率。
结果
(1)混合样本中，母体细胞污染达6.25%时就能影响地贫基因诊断结果。
(2)微滴式数字PCR最低可检测1.56%的母体细胞污染，定量荧光PCR无法检测该程度的母体细胞污染。
(3)75例临床样本中，微滴式数字PCR共检测到10例MCC(13%，10/75)，其中6例母体细胞污染小于6.25%，4例高于12.50%；定量荧光PCR检测到4例高于12.50%的MCC(5.3%，4/75)，二者差别有统计学意义(P=0.03)。
结论
低比例母体细胞污染就能影响检测基因诊断结果，因此确保产前诊断样本的高质量对于产前分子检测具有重要意义。本研究应用微滴式数字PCR成功鉴定产前基因诊断样本的母体细胞污染，微滴式数字PCR能精确检测低比例污染的发生，可辅助定量荧光PCR排除母体DNA干扰。
目的
本研究将基于母胎差异甲基化基因方法，筛选用于唐氏综合征无创产前筛查的胎儿标记物。通过高灵敏的微滴式数字PCR平台进行少量临床样本的验证，初步探究该方法的临床应用价值。
方法
(1)收集5例正常胎盘样本、5例唐氏综合征胎儿胎盘样本、5例正常非孕妇外周血样本，采用亚硫酸氢盐方法处理以上标本DNA。设计相应的引物，进行PCR扩增，根据电泳结果筛选差异甲基化基因，筛选后的基因进行测序分析以明确甲基化状态。
(2)选择2例正常胎盘、2例唐氏综合征胎儿胎盘及2例正常非孕妇外周血，按照胎盘DNA/(胎盘DNA+非孕妇外周血DNA)的50.00%、25.00%、15.00%、10.00%、5.00%，建立正常及唐氏综合征混合样本。采用亚硫酸氢盐方法及甲基化敏感的限制性内切酶方法处理混合样本DNA，选择胎盘中高甲基化、非孕妇外周血中低甲基化的基因用于目标基因与参照基因比值计算，根据混合样本的计算比值确定合适的目标基因及参照基因。
(3)选择8例正常孕妇外周血浆样本，采用亚硫酸氢盐方法及甲基化敏感的限制性内切酶方法处理混合样本DNA，评估差异甲基化基因的检出情况。
(4)回顾分析2017年1月至2017年3月在广东省妇幼保健院产前诊断中心进行介入性产前诊断手术的孕妇39例，采用甲基化敏感的限制性内切酶方法处理孕妇血浆样本DNA，评估该方法能否区分正常胎儿与唐氏综合征胎儿。
结果
(1)21号染色体上的HLCS基因、C21orf57基因及11号染色体上的PPFIA1基因均在胎盘中高甲基化，在非孕妇外周血中低甲基化。
(2)微滴式数字PCR最低可检测到5%的混合样本DNA，以HLCS/PPFIA1、C21orf57/PPFIA1建立比值时，能区分正常样本和唐氏综合征样本。
(3)8例正常临床样本DNA经甲基化敏感的内切酶消化后，微滴式数字PCR均能检测到HLCS基因、C21orf57基因及PPFIA1基因拷贝数。亚硫酸氢盐处理后的样本DNA，微滴式数字PCR只能检测2例晚孕期样本的HLCS基因及PPFIA1基因拷贝数。
(4)39例孕妇血浆样本DNA经甲基化敏感的内切酶消化后，除1例正常胎儿样本比值高于正常样本上限外，其余24例正常胎儿与14例唐氏综合征胎儿样本均正确分类。
结论
21号染色体上的差异甲基化基因HLCS、C21orf57基因可作为唐氏综合征筛查的胎儿特异性标记物，有望根据微滴式数字PCR计算的HLCS/PPFIA1、C21orf57/PPFIA1比值，进行唐氏综合征无创产前筛查的研究。
第二章微滴式数字PCR检测产前基因诊断样本的母体细胞污染的初步研究
目的
建立基于微滴式数字PCR平台的产前基因诊断样本母体细胞污染鉴定的新方法，对绒毛、羊水、脐血样本进行母体细胞污染鉴定，降低误诊漏诊的发生。方法
(1)选择夫妇双方均为同型β地贫基因携带者，基因型包括βN/βCD41-42、βN/βⅣS-Ⅱ-654、βN/β-28；胎儿地贫基因为βN/βN、βCD41-42/βCD41-42、βⅣS-Ⅱ-654/βⅣS-Ⅱ-654、β-28/β-28的家庭75例。
(2)按孕妇DNA/(孕妇DNA+胎儿DNA)的50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%、1.56%进行混合，建立以下样本的MCC梯度模型：βCD41-42/βCD41-42—βN/βCD41-42、βIVS-Ⅱ-654/βⅣS-Ⅱ-654—βN/βⅣS-Ⅱ-654、β-28/β-28—βN/β-28、βN/βN—βN/βCD41-42、βN/βN—βN/βⅣS-Ⅱ-654、βN/βN—βN/β-28，反向斑点杂交技术检测混合样本的地贫基因型，定量荧光PCR与微滴式数字PCR方法分别进行母体细胞污染鉴定。
(3)定量荧光PCR与微滴式数字PCR方法同时检测75例产前诊断样本，比较母体细胞污染检出率。
结果
(1)混合样本中，母体细胞污染达6.25%时就能影响地贫基因诊断结果。
(2)微滴式数字PCR最低可检测1.56%的母体细胞污染，定量荧光PCR无法检测该程度的母体细胞污染。
(3)75例临床样本中，微滴式数字PCR共检测到10例MCC(13%，10/75)，其中6例母体细胞污染小于6.25%，4例高于12.50%；定量荧光PCR检测到4例高于12.50%的MCC(5.3%，4/75)，二者差别有统计学意义(P=0.03)。
结论
低比例母体细胞污染就能影响检测基因诊断结果，因此确保产前诊断样本的高质量对于产前分子检测具有重要意义。本研究应用微滴式数字PCR成功鉴定产前基因诊断样本的母体细胞污染，微滴式数字PCR能精确检测低比例污染的发生，可辅助定量荧光PCR排除母体DNA干扰。